GB/T19495.9-2017
转基因产品检测植物产品液相芯片检测方法
Detectionofgeneticallymodifiedorganismsandderivedproducts—Liquidbeadarraydetectionforplantproducts
- 中国标准分类号（CCS）A40
- 国际标准分类号（ICS）07.080
- 实施日期2018-07-01
- 文件格式PDF
- 文本页数6页
- 文件大小457.82KB
以图片形式预览转基因产品检测植物产品液相芯片检测方法
转基因产品检测植物产品液相芯片检测方法
国家标准 GB/T19495.92017 转基因产品检测 植物产品液相芯片检测方法 Detectionofgenetieallymodifiediorganismsandderivedproduets- Liguidbeadarradeteetionforplantproducts 2017-12-29发布 2018-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB;/T19495.9一2017 转基因产品检测 植物产品液相芯片检测方法 范围 GB19495的本部分规定了转基因成分的液相芯片定性检测方法
本部分适用于玉米大豆、油菜、水稻、棉花等转基因植物及其产品CaMV35S和NOS基因的定性 检测
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的,凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 缩略语 下列缩略语适用于本文件
eraseChainReaction PCR聚合酶链式反应(Polyme MFI;中位荧光强度值(MedianFluorescencelIntensity) SA-PE:链霉亲和素-藻红蛋白(Streptam ridinR-Phycoerythrin) 原理 液相芯片技术以荧光编码微球为基础,微球表面带有大量的活性基团,可与核酸探针、抗原、抗体等 分子偶联
微球在制备过程中掺人了红色和橙色两种染料按照比例混合而成的荧光染料,两种染料分 通过不同配比赋予了微球不同的颜色,从而把微球分为很多种,每种微球特异性的偶联针对目的DNA 序列的寡核苷酸探针,就可以标记100种不同的探针分子
然后依次加人目的分子和带有荻光的报告 分子,不同微球上的探针分子与不同的目的分子实现特异性结合,形成一个灵活性的液相芯片系统
该 方法的信号识别与检测技术是流式细胞术,它可以将微球体快速排成单列通过检测通道,使用红色和绿 色两束激光对单个微球进行照射,红色激光通过分辨微球本身的光谱学指纹将微球分类对反应进行定 性;绿色激光通过检测微球上结合的荧光报告分子量对反应进行定量
所得到的荧光信号经过光电倍 增管后经电脑处理,最后对数据进行分析,得出结果
检测时,液相芯片检测仪只记录两种荧光同时出 现时的荧光信号,不记录未结合的荧光报告分子信号
本标准针对通用筛选元件CaMV35S启动子和NOS终止子设计选取特异性引物和探针进行液相 芯片检测,并根据检测结果来判定CaMV35S启动子和NOS终止子的外源筛选元件成分
GB/T19495.9一2017 5 试剂与材料 除非有特殊说明,仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水
5.1DNA提取试剂盒 推荐针对不同的样品基质类型选取不同的基因组提取试剂盒
5.218srRNA基因引物和探针 18s-F:5'-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3’” 18s-R;5’-生物素-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3 18、-P.5’-氨基-12个碳基-TGCGCGcCTGCTGCCTTcCT-3 5.3CaMIV35S启动子基因引物和探针 CaMV35SF;5'-ATTGAGTGATATcTcCACTGAcG;T-3" "生物索ccreTccAAATGAAATGAAcTTccT3 CaMV35SR:5” 氨基-12个碳基-CccAcTATcCTTcGCAAGAccCTTcCT-3” CaMV35S-P:5” 5.4NOs终止子基因引物和探针 NOs-F;5'CATGTAATGcATGAcGTTATTTATG3" NOs-R:5’-生物素-TTGTTTTCTATcGCGTATTAAATGT-3" NOs-P:5 氨基-12个碳基-ATGGGTTTTTATGATTAGAGTcccGCAA3 5.5荧光微球 梭基荧光微球,有5.64m或者6.54m两种规格,不同编号微球可偶联不同探针
5.610×PCR缓冲液 用于PCR扩增反应,含有Tris-HCl(pH8.3)、KCl和MgCl
5.7dNP溶液 含有dATP,dTTP,dCTP和dGTP(各2.5mmol/L
5.8ExTaqDNA聚合酶 具有3'-5'核酸外切酶活性的耐热性DNA聚合酶(5IU/L. 5.9IMIAC杂交液 氯化四甲胺(tetramethylammoniumchloride)杂交液
6 仪器与设备 6.1I级生物安全柜
6.2涡旋震荡仪
6.3PCR仪,平均温度变化速度0.1C/s.
GB;/T19495.9一2017 6.4液相芯片检测仪,报告激光;532nm;分类激光:635m.
操作步骤 7.1抽样 按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的规定执行
7.2制样 按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的规定执行
7.3试样预处理 按照GB/T19495.l和GB/T19495.3的规定执行
S 7.4DNA模板制备 按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的规定执行 7.5PCR反应 7.5.1PCR反应体系和反应条件 7.5.1.1PCR反应体系 PCR反应体系应在I级生物安全柜中操作
50l反应体系中含10×PCRBuffer5L. 2.5mmol/L.dNTP4l,10mmol/儿的上下游引物包括18s-F、18s-R.CaMV35S-F,CaMV35s-R、 NOS-F和NOS-R)各1L,DNA模板1L(100ng),ExTaq酶0.5L,补双蒸水至终体积50L
每 个DNA样品做2个平行管(若平行误差超过10%,应重新检测)
加样时应使样品DNA溶液完全加人 反应液中,不要粘附于管壁上,加样后应尽快盖紧管盖,用涡旋震荡仪混匀
7.5.1.2PCR反应条件 95C预变性5min;94C变性30s,58C退火30s,72C延伸30s,35个循环;72C延伸10min
7.5.1.3对照设置 在液相芯片检测样品的同时,应设置阴性对照与空白对照,以与试样相同种类的非转基因植物基因 组DNA作为阴性对照;以水作为空白对照
各对照的PCR反应体系中,除模板外,其余组分及PCR反应条件与7.5.1.1相同
7.5.2仪器设置 设定样品名称、探针编号和类型,微球数量等
7.5.3杂交反应体系与杂交反应条件 7.5.3.1杂交反应体系 50L杂交反应体系中包括:1.5×TMAC杂交液33HL,与18s-P,CaMV35S-P,NOs-P三种探针 探针浓度为100mol/L)偶联的微球各0.5L(每种微球约5000个),Tris盐酸盐(pH=8)缓冲液 5AL,PCR产物2AL,空白孔以2"L.Tris盐酸盐(pH=8)缓冲液取代PCR产物,阴性对照孔加2L
GB/T19495.g一2017 阴性PCR产物
7.5.3.2杂交反应条件 95C变性5 min， ,58杂交30min,加人1×TMAC杂交液稀释的sA-PE(24g/mL)100AL 58孵育10min. 7.5.4杂交结果检测 按预先设定的样品摆放顺序将杂交后的反应液转移到检测板上,运行仪器进行荧光检测 结果分析与表述 8. 总则 在设置的读数时间内,荧光编码微球个数>20个,表明用于计数的荧光编码微球数量有效,所产生 的中位荧光强度(MFI)值可信;各个荧光编码微球的空白对照MFI均不高于300,表明结果有效,试验 可进行结果判定;若内标准基因未出现阳性结果,说明实验不成功,需重新进行检测
8.2结果判定 测试样品的中位荧光强度(MFI)大于或等于空白对照值的3偕即可判为阳性结果
测试样品的中位荧光强度(MFD大于空白对照值的2倍小于空白对照值3倍判为可疑,需进行重 复检测或采用其他方法确认
测试样品的中位荧光强度(MFI)小于空白对照值的2倍即可判为阴性结果
8.3试样检测结果分析和表述 8.3.1内标准基因出现阳性结果,并且外源CaMV35s或NOS基因的任何一个检出阳性,这表明试样 中检测出了CaMV35s或NOS基因,表述为“试样中检测出了CaMV35S或NOs基因成分,检测结果 为内源18SrRNA基因出现阳性结果,CaMV35S或NOS基因出现阳性结果,检测灵敏度为0.01%”" 8.3.2内标准基因出现阳性结果,而CaMV35S或NOs基因未检出阳性,这表明试样中未检测出 CaMV35S或NOs基因成分,表述为“试样中内源18SrRNA基因出现阳性结果,检测灵敏度为0.01% 未检测出CaMV35S或NOS基因成分”
转基因产品检测方法——液相芯片检测GB/T19495.9-2017
随着人们对食品安全的日益重视，越来越多的国家开始加强对于转基因产品的监管。转基因技术在植物领域得到广泛应用，然而这种新技术也带来了一系列的质量和安全问题。因此，如何快速、准确地检测转基因产品成为一项亟待解决的难题。
液相芯片检测技术是一种高通量、高灵敏度的分析方法，已经被广泛应用于药品、生化制品、环境污染等领域。液相芯片检测能够同时检测多个指标物质，具有检测速度快、结果可靠、操作简单等优点。因此，该技术的应用前景十分广阔。
在转基因产品检测中，液相芯片检测技术也展现出了其强大的优势。以水稻为例，可以采用PCR扩增转基因片段后再进行芯片检测，从而实现对于转基因水稻的快速检测。同时，该技术还可以用于检测转基因食品中的成分和含量，有效保障人们的食品安全。
GB/T19495.9-2017标准规定了液相芯片检测方法在转基因产品检测中的应用要求。该标准明确了检测方法、检测步骤、结果判定等细节问题。其中，检测方法包括样品前处理、DNA提取、PCR扩增、液相芯片检测等步骤。通过严格遵守标准规定，可以确保液相芯片检测结果的准确性和可靠性。
总之，液相芯片检测技术是一种极具潜力的转基因产品检测方法。该技术能够快速、准确地检测转基因物质，有望在未来广泛应用于农业、食品安全等领域。
