转基因植物产品数字PCR检测方法

转基因植物产品数字PCR检测方法

国家标准 GB/T33526一2017 转基因植物产品数字PCR检测方法 GenetieallymodifiedorganismdeteetionmethodlbydigitalPCR 2017-02-28发布 2017-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/33526一2017 转基因植物产品数字PCR检测方法 范围 本标准规定了转基因成分检测的数字PCR方法 本标准适用于玉米、大豆,油菜,水稻、马铃薯、首瘤、棉花等转基因植物及其产品的转基因成分数字 PCR检测 本标准所能达到的检测低限为0.1%(质量分数). 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 18srRNA基因18srRNA gene 转录自18srDNA,是细胞核糖体的组分之 3.2 CaMv35s启动子基因CaMIv35sprommotor 来自花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaievirus，CaMV)的35、启动子 3.3 NOs终止子基因NOsterminitor 来自胭脂碱合成酶基因NOs的终止子 原理 数字PCR其技术原理是通过将原始PCR反应体系进行分割,进而对所有小的反应体系进行扩增 并后续检测 通过对反应体系进行有限的分割,从而使整个反应体系可以更加耐受核酸抑制因子,并且 更加稳定、准确、快速地对痕量的转基因成分进行精准鉴定 现阶段数字PCR的实现形式包括芯片式数字PCR与微滴式数字PCR两种 其中芯片式数字 PCR通过微流控芯片实现对原始反应体系的分割,这种分割方式具有稳定性好、均一性好的优点,但是 这种分割方式的实验成本相对较高;微滴式数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分
GB/T33526一2017 割 这种分割方式具有反应速度快,分割成本低的优点,但是相对来说,这种分割方法的稳定性较差,而 且对于数据分析的要求也相对较高 由于数字PCR的平台差异,对不同数字PCR平台进行的数据协 同分析也成为了目前数字PCR检测方法发展的关键 本标准针对通用筛选元件CaMV35s启动子和NOS终止子设计选取特异性引物和探针进行数字 PCR扩增,并根据扩增结果来判定CaMV35s启动子和NOS终止子的外源筛选元件成分 另外,通过 芯片式数字PCR和微滴式数字PCR的协同比对,本标准方法可以在两种平台中达到同样的检测目的 5 试剂与材料 除非有特殊说明,仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水 5.1DNA提取试剂盒 推荐针对不同的样品基质类型选取不同的基因组提取试剂盒 5.2数字PCR反应试剂盒 推荐按照不同的数字CR平台的说明书选取其推荐的数字PCR反应试剂盒 5.318srRNA基因引物和探针 18s-F:5'-CCTG.AGAAACGGCTACCAT-3 8s-R:5'-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3 8s-P;5'-VICTGcGcGccTGcTGccTTcCT-BHQ1-3' 5.4CaMIv35s启动子基因引物和探针 p35、-F:5'-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3' D35s-R;5'-cCTcTcCAAATGAAATGAACTTccT-3' p35s-P:5'-VIC-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-BHQ1-3 5.5NO5s终止子基因引物和探针 TNOs-F;5'-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3 TNOs-R:5'-ATTGCGGGAcTCTAATCATA-3 TNOS-P.5'-Vvc-CATcGCAAGAccGGCAAcAGGBHQ1-3' 6 仪器与设备 6.1分析天平:感量0.1mg 6.2生物安全柜 6.3数字PCR扩增仪 6.4纯水仪 6.5核酸定量仪 6.6涡旋震荡仪 6.7其他相关仪器和设备 6.8离心管
GB/33526一2017 6.9不同量程移液器以及配套吸头如下 量程为20AL200AL,10L100L和2L20l的移液器以及配套的200L吸头 a b)量程为0.5L一10L和0.laL一2.5AL的移液器以及配套的10L吸头 操作步骤 7.1抽样 按照G;B/T19495.1和GB/T19495.7的规定执行 7.2制样 按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的规定执行 7.3试样预处理 按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的规定执行 7.4DNA模板制备 按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的规定执行 7.5数字CR扩增方法 7.5.1试样数字CR反应 内标准基因数字R反应 7.5.1.1 每个试样内标准基因数字P(CR反应设置3个平行 并按照表1的组分和终浓度配置数字PCR反 应体系 反应体系配置完成后,进行反应体系的分割,其中芯片法数字PCR通过微流控芯片实现本步 骤,微滴法数字PCR通过形成油包水结构实现体系的分割 该步骤按照不同数字PCR平台的说明书 进行操作 数字PCR反应的有效分割体系数不得低于理论分割体系数的60% 表1数字PCR反应体系 试剂 终浓度 体系 2×反应Mix 2Al 20mol/LzSSIIbF/p35s-F/TNOSF 0,45mol/I 0.09 20mol/IzSSIIbR/p35s-R/TNOSR 0,45mol/I 0,09A 20mol/L2SSIIbP/p35s-P/TNOSP 0.1Anmol/L 0,02A 50ng/LDNA模板 12.5ng/l 1Al 水 补齐4AL 总体系 4l 推荐市面上现售的数字PCR平台进行实验,并针对市面上现售的不同数字PCR平台,依据说明书调整反应体 系的组分和最终体积,并保证表中所列组分的终浓度不变
GB/T33526一2017 体系分割完成后,进行数字PCR反应 荧光分析步骤采用VIC单荧光通道,反应程序如表2 所示 表2数字CR反应程序 步骤 持续时间 温度 循环数 50C 2min 热激活 95 5minm 95 变性 15s 40 退火延伸 60 lmin 注:不同CR反应平台可以根据说明书对热启动步骤程序进行修改,但是不能对扩增程序进行修改 7.5.1.2外源基因p35s与T-NOs基因数字PCR反应 每个试样外源基因数字PCR反应设置3个平行 外源基因扩增所用反应体系与反应程序与7.5.1.1 相同,扩增所使用的引物探针为5.4与5.5所述引物探针 7.5.2对照数字CR反应 在试样数字PCR的同时,应设置阴性对照与空白对照 以与试样相同种类的非转基因植物基因组DNA作为阴性对照;以水作为空白对照 各对照PCR反应体系中,除模板外,其余组分及PCR反应条件与7.5.1相同 8 结果分析与表述 8.1值的设定 根据数字PCR结果中扩增曲线的基线或者体系中阴性分割体系的终点荧光值设定荧光的值限 阀值限需要对阴性和阳性扩增结果进行明显的区分 8.2对照组检测结果分析 阴性对照组只有内标准基因的扩增,空白对照组没有任何扩增现象,这表明数字PCR反应体系正 常工作,否则需要进行重新检测 8.3试样检测结果分析和表述 8.3.1内标准基因得到了明显的扩增,并且外源p35、或NOS基因的任何一个出现明显的扩增现象， 阳性扩增体系内扩增曲线形状良好或者其终点荧光信号值超过荧光阔值,这表明试样中检测出了p35s 或T-NOs基因,表述为“试样中检测出了p35s或NOs基因成分,检测结果为阳性” 8.3.2内标准基因得到了明显的扩增,且其扩增曲线形状良好并超过值限,而p-35s或T-NOS基因 都没有得到扩增,扩增终点荧光信号值位于值限之下,这表明试样中未检测出p35s或T-NOS基因
GB/33526一2017 成分,表述为“试样中未检测出p35s或T-NOSs基因成分,检测结果为阴性” 8.3.3内标准基因没有得到扩增,扩增终点荧光信号值位于阔值限之下,这表明试样中未检测对应植 物成分,结果表述为“试样未检出对应植物成分检测结果为阴性”

转基因植物产品数字PCR检测方法GB/T33526-2017

随着转基因技术的发展，越来越多的转基因植物产品被开发和推广。在转基因植物产品上市前，需要进行检测以保证其质量和安全性。数字PCR检测技术是一种高灵敏度、高精确度的检测方法，已被广泛应用于转基因植物产品检测中。

GB/T33526-2017是中国国家标准化管理委员会发布的转基因植物产品数字PCR检测方法标准，该标准规定了数字PCR检测技术在转基因植物产品检测中的应用范围、样品处理、引物设计、PCR条件、数据分析等方面的要求。

数字PCR检测技术相比传统的PCR技术具有更高的精确度和可重复性，能够有效地避免假阳性和假阴性结果的出现。该技术利用数字式检测系统对PCR产物进行计数，从而得出样品中转基因序列的比例。

数字PCR检测技术的检测灵敏度可以达到0.1%以下，能够检测到极低浓度的转基因序列。此外，该技术还可以同时检测多个转基因事件，具有高通量、高效率的特点。

在数字PCR检测过程中，样品处理和引物设计是影响检测结果准确性的重要因素。样品处理需要避免污染和杂交现象的发生，并且需要提取样品中的DNA以供检测。引物设计则需要选择与转基因序列特异性较高的引物，避免与非目标序列的杂交。

GB/T33526-2017标准对数字PCR检测技术的应用进行了规范，为转基因植物产品检测提供了技术支撑和标准参考，有助于保障转基因植物产品的质量和安全性。

转基因植物产品数字PCR检测方法的相关资料

和转基因植物产品数字PCR检测方法类似的标准

GB/T33526-2017

转基因植物产品数字PCR检测方法

2022/9/25 3:51:11 现行

GB/T38132-2019

转基因植物品系定量检测数字PCR法

2022/7/28 13:48:33 现行