动物性材料（羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒）属性DNA鉴定方法实时荧光PCR法

动物性材料（羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒）属性DNA鉴定方法实时荧光PCR法

国家标准 GB/T32132一2015 动物性材料羊毛羊绒、鸭绒、鹅绒)属 性DNA鉴定方法实时荧光PCR法 DNAidentificationofwool，cashmere，duck'sdown，go0se'sdown animal mmaterials一Real-timefluorescencePCRmethod 2015-10-09发布 2016-11-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T32132一2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口 本标准起草单位深圳市计量质量检测研究院、测试技术研究院、珠海出人境检验检疫局 本标准主要起草人:陈国培、赖心田、林霖、周李华、梁玉英、莫秋华将洪晓明、唐复润、胡科新、 何永盛、杨友红、杨志敏、杨国武、杨泽
GB/T32132一2015 动物性材料(羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒)属 性DNA鉴定方法实时荧光CR法 范围 本标准规定了羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒动物性材料中DNA成分实时荧光PCR定性检验方法 本标准适用于动物性材料中羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒等动物源性DNA成分的鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 件 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 原理 本标准使用十二熔基硕酸钠-异硫氧酸呱-丹豌基乙醉法或其他等效DNA提取法,获得适用于实时 荧光PCR检测的DNA 同时依据多种动物的物种特异性基因片段设计成特异性荧光引物,通过实时 荧光PCR反应,检测其中是否含有各种动物源性DNA成分,从而达到对动物性材料进行属性DNA成 分定性检测的目的 仪器设备及器具 4.1实时荧光PCR仪 4.2超净工作台 4.3离心机(最高转数15000g) 4.4微量移液器0.2l一2L.ll一10L.2L一20AL.20AL一200AL.200L一1000AL 4.5恒温水浴锅:(65士1)C 4.6超纯水系统(电阻率>18.2MQcm) 4.7紫外分光光度计;230nm,260nm,280nm 5 试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂,水应符合GB/T6682一级水要求 5.12%SDS溶液:称取2gSDs(sodiumdodeeylsulfate，sodiumsalt,十二烧基磺酸钠)粉末,加人 5 mL1mol/LTris-HCl(pH8.0[Tris-;trishydroxymethyl)aminomethane,三(胫甲基)氨基甲婉了 及 4ml.0.5mol ol/LEDTA(pH8.0)(ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸),加水定容至 100 mL,室温保存 5.2异硫氰酸呱提取液;称取47.25g异硫氮酸、1.75g氯化钠、4gPVPK-40(Polyinylpyrrolidone mol/LEDTAN K-40,聚乙烯毗咯酮K-40),加人5ml1mol/ITris-HCl(pH8.0)及4mL0.5
GB/T32132一2015 (pHH8.0),加水定容至100mL,室温保存 5.31moal几TieHc(pH8.0)800mL水中溶解121.1【Ti、碱,盐酸调pH值至8.0,加水至 1000ml,高压灭菌,室温保存 5.40.5mol/儿EDTApH8.0):800mL 水中溶解186.1g乙二胺四乙酸二钠盐,NaOH调pH值至 8.0,补水至1000mL,高压灭菌,室温保存 5.53mol/L乙酸钠溶液;称取408.1g三水乙酸钠,加人800mL水溶解,用冰乙酸调节pH值至5.2 加水定容至1000mlL,高压灭菌,4C保存 5.6酚:氯仿:异戊醇;25:24:1(体积比 5.7担体;非同一物种的植物或非脊椎动物基因组DNA,推荐使用糖原 5.8无水乙醇、异丙惊、-硫基乙醇等有机试剂 5.9PremixExTaq(2×),也可用等效的其他Taq酶或Ta酶预混液 5.10引物和探针:动物性材料中羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒等动物源性DNA成分实时荧光PCR检测所用 的荧光引物序列见表1 表1实时荧光PCR检测所用荧光引物序列 检测基因 引物序列 探针序列 脊椎动物 5’-AGATAGAAACCGACCTGGATT-3” 5'-F:AM-TccGGTcTGAAcTCAGATcAcGTA-BHQ-3 内参照基因 5-TTTACGAcCTcGATGTTGGAT-3” I5'-FAMTGGAGCTTTAACTAAGTAACTCAAGGA-BHQ3’ 羊毛内源基因5*ACTTccAATcAGTGAAATTGAC-3” 5'-TTCTCCGAGGTCACCCCAA3’ 5'-FAMTGGAGCTTTAACTAACTAGTCCAAAAG-BHQ-3 羊绒内源基因 5FANMNCNNTANTNCCNCGTANANTGCCAA-HQ3 鸭绒内源基因 5'’-ACGTACANTACCGCCCGTCA-3’ 5'-FAMACATAACTAATACCCTAAACATGCCAA-BHQ3 5’-ATTcTAAGTACAccTTCCGGT-3" 鹅绒内源基因 5'-FAM-ATAACTAANTACCATAAATACGCTGAA-BHQ3’ 操作步骤 6.1模板DNA的提取 6.1.1十二炕基磺酸钠-异硫酸肌-扑流基乙醇DNA提取法 于样品不同部位取样,取0.05g一0.1g剪醉样品,加人3mL2%SDS溶液,65C水浴1.5h,不时 振荡;12000g离心5min,弃去上清液;加人3m异硫酸呱提取液及60ALB筑基乙醇,65C水浴 4.5h,不时振荡;12000离心5min,吸取上清液;加人等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),颠倒混 匀;12000离心10min;吸取上清液,加人320mg/mL糖原,1/10体积的3nmol/儿乙酸钠溶液 (pH5.2)及等体积异丙醇，一20C沉淀过夜,12000片离心15min收集沉淀;小心倒去上清,用70% 醇洗涤二次,风干;加人50Al灭菌去离子水溶解沉淀 6.1.2模板DNA提取的其他办法 可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA 6.1.3样品DNA质量评估 nm和280nm 取10LDNA溶液加蒸馏水稀释至1mL,用紫外分光光度计分别测定260 的吸光
GB/T32132一2015 值,DNA的浓度按照式(1)计算,当OD.m/OD比值在1.52.0之间时,符合PCR检测要求 扩增前 将所有样品DNA调至约10g/Al一10ng/L c=A×N×500/100o 式中: -DNA浓度,单位为纳克每微升(ng/aL); 260nm处的吸光值; A N 核酸稀释倍数 6.2试样的rCR反应 6.2.1阳性对照和空白对照的设置 6.2.1.1阳性对照 以含所检源性成分的动物性材料及其加工产品的DNA为模板 6.2.1.2阴性对照 以不含所检源性成分的动物性材料及其加工产品的DNA为模板 6.2.1.3空白对照 一是提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品),二是rPCR反应的空白对照(以 设置两个， 水代替DNA模板) 6.2.2实时荧光PCR反应体系 实时荧光PCR反应体系见表2,每个样品各做两个平行管 加样时应使样品DNA溶液完全落人 反应液中,不要粘附于管壁上,加样后应尽快盖紧管盖 表2实时荧光CR反应体系 体积 试剂名称 PremixExTaq(2× 10山 104mol/L引物(上游 0.4l 10Amol/L引物(下游 0.4L 10Mmol/L探针 0.2l DNA模板 10ng~100ng 补水至 20a 注，表中DNA模板的加样量,可视所提取DNA的浓度适当增减模板量 6.2.3实时荧光PCR反应参数 实时荧光PCR反应参数为;预变性95C30s,95C5s,60C34s,40个循环 注:不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整
GB/T32132一2015 6.3结果分析 6.3.1基线的设置 实时荧光PCR反应结束后,应设置无效基线范围 基线范围选择在3个15个循环,如果有强阳 性样本,应根据实际情况调整基线范围 闵值设置原则以基线刚好超过正常空白对照扩增曲线的最高 点,且C值=35为准 6.3.2实时荧光CR定性检验的质量控制 提取空白对照及PCR空白对照C值大于或等于35,阳性对照C值小于35 上述指标有一项不符合者,应重做实时荧光PCR扩增 结果判断与表达 7.1结果判断 待测DNA成分内源基因C值大于或等于35,脊椎动物内参照基因cC值小于35,阳性对照,阴性 对照和空白对照结果正常者,则可判定该样品未检出×××源性DNA成分 待测DNA成分内源基因c，值小于35,脊椎动物内参照基因c,值小于35,阳性对照、阴性对照和 空白对照结果正常者,则可判定该样品检出×××源性DNA成分 待测DNA成分内源基因c值大于或等于35,脊椎动物内参照基因c，值大于或等于35,阳性对 照、阴性对照和空白对照结果正常者,则可判定该样品未检测到DNA成分 7.2结果表述 该样品检出×××源性DNA成分 该样品未检出×××源性DNA成分 该样品未检测到DNA成分

动物性材料属性DNA鉴定方法实时荧光PCR法GB/T32132-2015

随着现代科技的不断发展，人们对动物性材料的鉴定方法也越来越高。在这里我们将介绍一种新的动物性材料鉴定方法——实时荧光PCR法。

实时荧光PCR法介绍

实时荧光PCR法是一种快速、灵敏、准确、可靠的DNA检测方法。它基于聚合酶链式反应（PCR）技术，通过荧光信号实时监测PCR产物的生成情况，从而实现DNA定量和检测。

相比传统的PCR方法，实时荧光PCR法具有更高的灵敏度和特异性，能够检测到更低浓度的DNA样品，且不需要后续的凝胶电泳等复杂步骤。

动物性材料鉴定

GB/T32132-2015《动物性材料属性DNA鉴定方法实时荧光PCR法》是我国当前动物性材料鉴定的标准之一。该标准以羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒等作为研究对象，基于实时荧光PCR技术，开发了一套适用于这些动物性材料的属性DNA鉴定方法。

该方法利用特异引物和探针设计，通过扩增目标DNA序列并监测荧光信号，实现动物性材料的快速、准确鉴定。同时，该方法具有高度的重复性和可靠性，并且适用于各种复杂样品，如混合样品等。

结论

实时荧光PCR法是一种高效的DNA检测方法，可以满足对动物性材料进行快速、准确鉴定的需求。GB/T32132-2015标准的制定和实施，为动物性材料行业提供了科学、规范的鉴定方法和技术支持，有助于保障消费者合法权益，促进动物性材料市场的健康发展。

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2022/10/21 10:40:46 现行