动物制品中动物源性检测基因条码技术Sanger测序法

动物制品中动物源性检测基因条码技术Sanger测序法

国家标准 GB/T35918一2018 动物制品中动物源性检测基因条码技术 Sanger测序法 dentifieationofanimalorigininanimalproductsbyDNAbareoding Sangersequencing 2018-02-06发布 2018-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35918一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/Tc387)提出并归口 本标准起草单位:检验检疫科学研究院 本标准主要起草人:吴亚君、陈颖、杨艳歌,黄文胜、王斌、韩建勋、刘鸣畅、张九凯、邓婷婷
GB/35918一2018 动物制品中动物源性检测基因条码技术 Sanger测序法 范围 本标准规定了基因条码技术Sanger测序法的原理、主要试剂,主要仪器设备,样品采集与制备、检 验步骤、质量控制、结果判定与表述、检验过程中防止交叉感染的措施 本标准适用于以哺乳类、禽类、鱼类动物的肉、乳、血液、毛发,角骨、内脏,皮张等来源的动物制品及 饲料物种的定性检测 注1，物种参见资料性附录A 注2;基因条形码技术Sanger测序法的检出限为10%质量分数) 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的,凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T9695.19肉与肉制品取样方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T19495.32004转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T21104动物源性饲料中反乌动物源性成分(牛、羊、鹿定性检测方法PCR方法 GB/T274032008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SN/T3500一2013进出口食品安全生物学检测抽样规范 术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1.1 基因条码DNAbarcode 生物体一段公认的能够代表该物种的标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段 3.1.2 Sanger测序法sangersequenecng 双脱氧链终止法 以单链或双链DNA为模板,在DNA聚合酶的催化下延伸结合在模板上的引物,直到掺人一种链 终止核苷酸为止 每个反应含有四种dNTP,并混人用同位素或荧光标记的ddNTP,使延长的寡聚核 苷酸选择性终止,通过高分辨率变性毛细管电泳分离片段获得碱基顺序的方法 3.1.3 基因条码技术DNA barcodling 采用基因测序技术对物种的基因条码进行识别,利用其种内特异性和种间多样性实现对物种的快
GB/T35918一2018 速鉴定的技术 3.1.4 质量评分Qualityvalue;QV 仪器测序过程中,软件分析测序信号时,根据预测到的碱基解读错误率,给出针对每个碱基所对应 的质量评分,用以评估单个碱基的测序质量 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件 BOLD;生命条形码数据系统(TheBareodeofLifeDataSystem bp:碱基对(Basepair) nmoniumBromide CTAB;十六婉基三甲基澳化铵(Cetyltrithylamr DNA;脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleieAeid dNTP;脱氧核糖核苷三磷酸(DeoxyribonucleosideTriphosphate) ddNTP:双脱氧核糖核苷三磷酸(DideoxyribonucleosideTriphosphate EDTA:乙二胺四乙酸EthyleneDiaminetetraaceticAcid NCH美国国立生物技术信息中心(Naioml CenterforBiotechnologyInformation Qv,质量评分(QualityValue) TaqDNA聚合酶,耐热DNA聚合酶(TuqDNAPolymease) Tris;三(羚甲基)氨基甲婉[Tris(hydroxymethyl)Aminomethane 原理 基于基因条码技术,根据样品类型选择基因条码引物,扩增基因条码序列并双向测序,在数据库中 对序列进行比对,确定物种 主要试剂 5 除另有规定外,所有试剂均为分析纯 实验用水符合GB/T6682中二级水的要求 5.1TaqDNA聚合酶 5.2胶回收试剂盒 5.3分子量标准品(最小片段>20bp,最大片段<2000bp) 5.4琼脂糖 5.5溴化乙锭 5.6三氯甲 57 异丙醇 5.8无水乙醉 5.9dNTP混合液(dATP,dCTP,dG;TP,dTTP) 5.1010×PCR缓冲液 5.11无菌双蒸水 5.1270%乙醇 5.131.2mol/LNaCl溶液 5.14201 mg/ml蛋白酶K溶液 5.1510×电泳缓冲液;Tris54g/L,碉酸27.5g/儿L,10mmol/L.EDTA,pH8.0.
GB/35918一2018 5.16蛋白酶K缓冲液l×PCR缓冲液;20mg/mL蛋白酶K=1:1000. 5.17cCTAB提取液;20.00g/儿CTAB,81.9g/LNaCI,12.1g/儿Tris,7.50g/L.NaEDTA,pH8.0 5.18cTAB沉淀液:5.00g/LCTAB,2.50g/LNaCl,pH8.0. 主要仪器设备 6.1P(CR仪 6.2凝胶成像仪 6.3电泳仪 6.4离心机:离心力17000g 6.5核酸蛋白分析仪 6.6 Ssanger测序仪 6.7组织研磨器 涡旋混匀仪 6.8 pH计精度为0.01 6.9 6.10 微量移液器0.5l一10L.,10AL一100l..20l一200L.,200l~100AL 6.11天平;分度值0.lmg 样品采集与制备 7.1采样 采样抽样参见GB/T9695.19,GB/T14699.1和sN/T3500-2013 7.2制备 7.2.1总则 样品充分混匀,分成三等分,作为检样、复检样和贮存样,样品的制备应防止交叉污染和组分改变 7.2.2肉品 从不同部位分别采集适量样品后混合,依次用70%乙醇和双蒸水冲洗2次一3次,收集到50mL 离心管或密封袋中,-20C以下冻存 7.2.3乳及乳制品 液态乳制品混匀,直接分装一20C以下冻存 固态乳制品粉碎,收集到50mL离心管或密封袋中 C8C保存 乳粉混匀后直接分装,收集到50mL离心管或密封袋中,4C一8C保存 7.2.4皮张、角骨、内脏等 依次用70%乙醇和双蒸水冲洗2次3次,粉碎,收集到50mL离心管或密封袋中,一20C以下 冻存 7.2.5血液 直接滴于采血卡上,晾干后，一20以下冻存
GB/T35918一2018 7.2.6毛发样品 分别用70%乙醇和无菌双蒸水冲洗2次一3次,收集到密封袋中,4C一8C保存 7.2.7饲料 混匀后直接分装,收集到50mL离心管或密封袋中,4C8C保存 8 检验步骤 8.1实验设置 检测设置阳性对照和空白对照(无菌双蒸水),其中阳性对照和空白对照DNA提取1次,待检样品 提取设置2个重复;所有DNA样品的CR扩增设置2个重复 8.2NA提取 8.2.1肉、乳,角骨,皮张、内脏等 按GB/T19495.3一2004中C.6.2CTAB2中的试验方法,并根据实际需要加人2ml10ml CTAB提取液,同时加人20L100L20mg/mL蛋白酶K(乳品等蛋白含量高的样品,用量增加 1倍)，65C温育1h一2h,期间不时震荡混匀 最后用50L100AL无菌双蒸水溶解DNA,混匀， -20C以下冻存 8.2.2血液 用采血卡剪取直径3mm左右的血斑于2mL离心管中,DNA提取方法参见B.1 8.2.3毛发 取清洗好的毛发,将毛囊端朝下放人200L离心管,剪去末端,加人20儿L蛋白酶K缓冲液,65 30min,9510min,4C10min,收集溶液于一20C以下冻存 8.2.4饲料 饲料DNA提取方法按照GB/T21104的规定执行 上述方法均可使用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA 8.3DNA浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A和A l280 DNA的浓度按式(1)计算,每个样品重复测3次,取平均值 通过OD/oD比值判断提取出的DNA 的纯度 若OD.a/OD.值在1.7~2.1之间,说明DNA纯度较高 C=A×N×50/1000 式中 DNA浓度,单位为微克每微升(4g/L); 260nm处的吸光值; N -核酸稀释倍数
GB/35918一2018 8.4CR扩增 8.4.1引物 扩增和测序引物见附录C 8.4.2反应体系 采用TaqDNA聚合酶扩增,酶及扩增体系参见B.2. 8.4.3反应参数 哺乳类、禽类、鱼类及微型基因条码反应参数分别见表C.1表C.3. 8.4.4 电泳检测 取2g琼脂糖,于100mL电泳缓冲液中加热,充分熔化,加人澳化乙锭贮存液至终浓度为0.5g/ml， 制胶 在电泳槽中加人电泳缓冲液,使液面刚刚没过凝胶 将25LCR扩增产物分别和适量加样缓 冲液混合,点样,同时点加分子量标准品,9V/em电泳仪中恒压电泳,直至澳酚蓝指示剂迁移至凝胶中 部 用凝胶成像仪观察电泳结果并记录 8.4.5胶回收及CR产物纯化 胶回收及PCR产物纯化参见B.3 8.5克隆纯化(适用于多组分和未知样品 -般地,PCR扩增后,电泳检测时如发现多条扩增带,则提示可能为混合样品,需进行克隆纯化 再测序 若扩增为单一条带,但测序时发现有多峰现象,提示可能为混合样品,也进行克隆纯化,再 测序 克隆纯化方法参见D.5 8.6测序 测序步骤参见D.6 8.7序列分析 使用序列拼接软件对双向序列进行拼接,去除标签序列和低质量区 将拼接后的序列在BOLD或 NCB数据库中进行序列比对,优先使用BOoLD,根据相似度判定物种 oLD网址;bhtp:/www.bodsytems.ors 注1:" 注2:NCB数据库网址:http://www.boldsystems.org 注3，使用oLD具体步骤.BoLD数据库一点击"鉴别"(aenmtifietion)一选择"动物鉴别"( AnimalsIdentification 一选择数据库(SearehDatabases)(建议选择ABarodeRecordsonBoLD)-粘贴fasta格式的序列(Enter sequeneesinfastaformat)-点击“提交”(Submit) 使用NCBI数据库具体步骤;NCB数据库-选择“BLAST”检索(BLAST)-选择“核酸比对”(Nueleotide BL.AsT)-一输人要查询的序列(EnterQuerySequenrce)- 一检索数据库选择“其他”(Database[ohersnr ete.)])点击“比对"BLAST)
GB/T35918一2018 o 质量控制 9.1总体要求 本章所列出的质量控制均应实现,有一条不满足时,实验视为无效,重新操作 9.2PCR质量控制 9.2.1阳性对照 9.2.1.1哺乳动物、禽类和鱼类基因条码片段电泳长度700bp左右 9.2.1.2微型基因条码片段电泳长度250bp左右 9.2.2空白对照 无PcR扩增条带 g.3基因克隆质量控制 阳性对照转化感受态细胞长出大量菌落,空白对照无菌落 g.4序列质量控制 g.4.1对序列进行质量核验,平均QV>30,QV<20的碱基数不超过序列总长度的1% 9.4.2哺乳类、禽类和鱼类基因条码片段经双向序列拼接后,保证测序峰图的长度>500bp 微显基因条码段经序列拼接后,保证测序峰图的长度>1alp 9.4.3 10结果判定与表述 0.1结果判定 在满足第9章全部质量控制的前提下,检测结果的判定如下 -样品序列与数据库相似度>90%,检测结果为相似度最高的物种 -若样品序列与数据库相似度<90%,则重复实验 若再次检测后,相似度>90%,则检测结果 为相似度最高的物种若相似度仍<0%,则本标准方法不适用于该样品 10.2结果表述 在样品序列与数据库相似度>90%,为相似度最高的物种时,其检测的结果应表述为样品中含有 ××来源动物物种 1 检测过程中防止交叉污染的措施 按照GB/T274032008中附录D的规定执行
GB/35918?2018 ? A ?? ?? A.lA.2A.3г???н? A.1鶯?? 17 Oisaries ÷? ersipo1 Caprahircu 18 Ceruselah4 ? ? Canislupus 19 ?? Pyrewulskiumalbirostri 20 è Nyctereutesprocyonoides Feliscatus Caelasacrian4s 21 Ratlusnoregicus 22 Oryctolagscuniculs С Musmu.sculus Cotuurni. Equscaba/lws Ase Equusasinus Ssscrofa Colnbaliuia ? 10 Bostaurs Meleagrisalloazo 11 ? ? Bosgrnies Gallusgall4s 12 Vulestules ? Syrrhatesparadlo.Z4sTuche 13 ? Phasianuscolcehicus ? Daadaa 14 ?? ?? GallusKallusdomesticus erZsunicolor ? 15 ?? Rangifertarandus Aqslayrhynchos 16 ? Eahuru.sdaidianus A.2? ( Lohiusitulon 16 ? Oreochromis 17 Merlucciuscabensis ? Cvnoscioiaaicesis (??) INMegalobramaamblycephala18 ? Epiephelws4woara 19 Ctenopharyngodonidella Pollachiusires Pangasianon 20 (?β ? 1ctalr5p4ctat4s hypophthal4s ? 21 Rhynchobatus Tenualosailisha 22 Ocorhwcusketa (? O.ryeleotrisarorrata 23 Gaduschaleogramm4 Saoalun 24 (??? Plectropousleoparduns Sconber 25 Omcrhynchwmyis 10 Simipereakeri 26 11 (?? C'hannargus Monoperusalbus 27 12 Chaetodliterr4sfaer CCarassiusgibelio 28 Larmichy Xiphiasgladis 13 COe 29 14 Nemipterusjaonics ??? Epinephelusfuscoguttatus 15 Cyprim4scarpio
GB/T35918?2018 A.3???? | 13 Canislupus Cirrhin4solitorella 14 Vuleslagopus Oryeleotrrisarorata Oryctolaguscuniculas 15 ?? Cynogloss4senegalensis ? Eu4sasin4s 16 ?β? Ietalurwspumctatus 17 M Equuscaballus Nemiperusjaponicus 18 ? ? erselabhs OIolithesruber 19 ÷? Bosgrnie1s Sconberiapoics ? Bosprimi 20 igeni4s Ocorhchsketa ? Neoisonison 21 Ocorhnchusm1ykiss 10 ? Canislupus 22 Salmosalar 1 Ouisaries 23 Therugrachaleogramma ? ?? 12 Capruhircus 24 NMerlweciusprodue4s 25 ? 13 Ssscrrofa Merlucciushubsi 26 Ratttu.s7norzegic45 Gadlsacrocephalu4s A4sboeeilorh3ncha 27 ? ? Aloboaibriaa Coturircolwrni." 28 Po/llachi4svirens Gallusgallus 29 Gdusmorhua Meleugrisgallopao 30 Pampusargentews Colwmalivia 31 C'eopharymgodomidella 32 (? Plectrob1usleoardls Ansercygoides 33 Cyriscarpio Pangasiaodlon1 ? hypopht phthals 34 Lariichthscroced ( lMegaloramaambMcehala (? Scohthalmusma.rimu4 35 Xiphiasgladius 36 CraSs74SaMrrat4S Lophiusitulon 37 ? Epinephelwscoioides (β Coiliamystus 38???)EpimepMhelesy/aoguan ? Scoeroorsnihoniuus 39 L.agocephalusspadicews ? ? Oreochrroisnilotics 40 Takifugologus () Chanaargus 1 Takifugurubries 2 ? Smi/ercdchuatsi ? Oreochrois 10 ?? Culeralbur4s 43 Prionaceglauca Teualosatoln 44 ? Rhynchobatus ? ThwwsalMucares
GB/35918一2018 附录 B 资料性附录 酶和试剂盒组成及使用说明 血液DNA提取试剂盒 B.1 B.1.1试剂盒组成见表B.1 表B.1血液DNA提取试剂盒组成 试剂名称 体积(100次 Blood(裂解液 lysisSolutionfor1 2.5ml NeutralizationSolutionforBlood(中和液 25ml 注;以ExtractN-AmpMBloodCRkit'为例 B.1.2操作步骤 血液滴于采血卡上自然脉干,剪成3mm左右的半径的采血卡于1.5mlL离心管中,加人20L裂 解液,55C15min,加人180aL中和液.涡旋或者颠倒混合，一20C存放 B.2反应体系 B.2.1IaqDNA聚合组成(见表B.2 一20C存放 TuDNA聚合酶室温或冰上融化,涡旋或者颠倒混合,离心直接吸取， 表B.2IaqNA聚合酶组成 试剂名称 体积 PCR ExtraetN-Amp1 reactionmix(PCR聚合酶混合物 2ml 注:以Extract-N-AmpPCRreactionmix为例 B.2.2扩增体系 上、下游引物各0.5L(引物浓度104nmol/L),12.54L PCR聚合酶混合物,5LDNA模板 101 100ng/L)，用无菌双蒸水补足体积至25AlL ng/Al" ectionmix均是sigma-AMarih公司提供的产品的 etNAmpBloodcRi和ExtractNAmpCR" Extract 商品名 给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可 如果其他等效产品具有相同 的效果,则可使用这些等效产品
GB/T35918一2018 B.3胶回收及PCR产物纯化试剂盒 B.3.1试剂盒组成(见表B.3 表B.3胶回收及CR产物纯化系统组成 体积/数量(50次) 产品组成 MembraneBindingSolution(膜结合液 20m 15ml Membranewashsolution(膜洗脱液 Nuelease-Freewater(无核酸酶纯水 3.75ml wizardSVMinicolumns(纯化柱) 50个 CollectionTubes2mL)(收集管 50个 注:Wizard像SVGelandPCRClean-UpSystem为例 B.3.2操作步骤 电泳检测结果为单一目的条带时,可直接对PCR产物进行纯化;若非单一条带,在紫外灯下小心地 把所需的DNA的片段切下来,并尽量去除多余的凝胶,再进行胶回收 具体步骤如下 若为CR产物,则直接加人等体积的膜结合液;若为凝胶,重量为Xg则加人XnmL膜结合 a 液(即;若凝胶的质量为0.2g,则加人膜结合液0.2mL);置于50C一65C温浴10min至凝 胶完全融化,其间每隔2min3nmin混匀一次 转移混合溶液至装于2ml收集管的纯化柱内,室温放置1min,14000r/min离心1min,弃 b 滤出液 加人700AL膜洗脱液(使用前按要求加人无水乙醇),l4o00r/min离心1min,弃滤出液 c 重复加人700膜洗脱液,室温下,l4000r/min离心5min,弃滤出液;14000r/min再次离 d 心1min,弃滤出液 转移柱子至1.5ml离心管中,加人20MlL50L无核酸酶纯水或者无菌双燕水,室温放置 1min，140001 r/min离心1nmin,纯化后溶液一20C以下保存 1 wizard四sVGdlandPCRCleanUpsystem是Promega公司提供的产品的商品名 给出这一信息是为了方便 本标准的使用者,并不表示对该产品的认可 如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品 10
GB/35918一2018 录 附 C 规范性附录 扩增与测序引物 哺乳动物和禽类基因条码引物序列见表C.1 鱼类基因条码引物序列见表C.2 动物制品通用微型基因条码引物序列见表C.3 测序标签引物序列见表C.4 表C.1哺乳动物和禽类基因条码引物(Mamm-ecktatl)序列 引物序列5’-3" 反应参数 引物名称 比例片段长度 VFL_tlTGTAAAAcGAcGGcCAGTTcTCAAcCAAccAcAAAGAcATTGG VRL_tlcCAGGAAACAGcTATGAcTAGACTTcTGGGTGGcCAAAGAATCA 94C预变性5min; FdLn ITGTAAAACGACGGCCAGTTCTCAACCAACCACAARGAYATYGG 9430s,5040s 72C60s,5个循环; VRd_tlcAGGAAAcAicTATGAcTAGAcrTcrG(GGTGGccRAARAAYcA 658bp|9430s,55C40s VFI_tlTGTAAAAcGAcGGcCAGTTcTcAAccAAccAIAAGAIATGG 72C60s,35个循环 72C延伸5 mln;4 VRi_lcAGGAAAcAGcTATGAcTAG.AcTTcTGGGTGIcCIAAIAAICAN 保存 LepFLTGTAAAAcGAcGGccAGTATTcAAccAATcATAAAGATATTGG LepRL_tllcAGGAAAcAGCTATGAcTAAAcTTcTGGATGTcCAAAAAATcA 注:阴影标注为M13F,M13R标签,扩增反应引物按照表中每对引物的比例混合而成 表c.2鱼类基因条码引物(Fish-coektail)序列 引物名称 引物序列5’3” 比例片段长度 反应参数 FishVF2_uTGTAAAAcGAcGciccANGTcAAccAAccAcAAAGAcATTGGcAc 94C预变性5 min; 94变性30s,52 FishR2_tlCAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAG,AA 退火40s,72C延伸 652bp 个循环 min，40 FishF2_tlTGTAAAAcGAcGGcCAGTcCG,ACTAATCATAAAGATATcGGCAC 72C再延伸10nmin 保存 IFishFRldtucAGGAAACAGcTATGACcAcCTcAGGcG;TGTccGAARAAYcARAA 注:阴影标注为M13F,M13R标签,扩增反应引物按照表中每对引物的比例混合而成 11
GB/T35918一2018 表C.3动物制品通用微型基因条码引物(Mini-b barde)序列 片段长度 引物名称 引物序列5’-3 反应参数 94预变性5min; FISHCOILBC_tsTGTAAAAcGAcGGCCAGTcTcAACYAATCAYAAAGATATYGGCAC 94C变性30s,51C 退火0s.72延伸 192p 30s,40个循环;72C " 再延伸1o min;4 REVshortl ICAGGAAACAGCTATGAcGGYATNACTATRAAG,AAAATTATTAC 保存 注:阴影标注为M3F,M3R标签 表C.4测序标签引物序列 引物名称 引物序列5'-3” -2c (G;ACG;GCCAGT TGTANC MI3F M13R-好 cAGG;AAACACTATGAc 12
GB/35918?2018 ?D ?? ? D.1÷Χ ??δ???,?? D.2 ?? Kan';ù(Kanamyein LB;???(LuriaBertani) D.3?? D.3.1? D.3.2LB .3.3DNA? D.3.4DNA?С D.3.5?? D.3.6塣 D.3.7 D.3.8??? D.3.995%? D.3.1070%? D4?豸 D.4.1? D.4.2?? D.43 D4.4?;17000 g D.4.5??:0.5ml10mlL,10ml100mL.,20ml~200ml.,200ml1000mL D.4.6 D.4.7? D.4.8 D.4.9CR D,4.10Sanger? 13
GB/T35918一2018 D5克隆纯化(适用于多组分和未知样品 多组分和未知样品的PCR产物连接RCRD2.1"'载体,连接反应体系共10AL,其中包含:PCR产物1AL 5×T4NA连接反应缓冲液2AL,PCRw2.1'载体(25ng/L)2AL,无菌双蒸水4AL,连接4C过夜连接 将 感受态细胞置于冰上融化,在超净工作台中,向100L感受态细胞悬液中加人1L的连接产物,轻轻旋转岗 心管以混匀内容物,冰上放置30 min 将离心管置于42恒温水浴锅中90s,然后快速转移到冰上放置 注意不要摇动离心管 向离心管中加人900AL.无抗生素的LB液体培养基,37C120r/nminm 振荡培养 2min， h,使菌体复苏 离心机上2000r/min离心,去除700AL.上清,用移液枪轻轻吹打混匀以悬浮菌体后将其涂 布于添加kan'固体LB培养基(含琼脂)中,37C恒温培养箱中倒置培养12h16h 挑取单菌落(>20个) 于1ml.含Kan'抗生素的LB液体培养基,37C恒温摇床中孵育10h16h,取1AL菌液进行CR,电泳检 测,挑选阳性产物进行测序 D6测序 测序反应体系共10AL,其中包含DNA测序试剂盒(5×Sequenecing缓冲液1AL,IBigDyeTerminator V3.12AL),10nmol/几引物0.16AL(正向测序用引物M13F,反向测序用M13R),无核酸酶纯水5.84AL,纯化 后的CR产物或质粒DNAlAL 用铝箔纸薄膜密封96孔板 PCR仪扩增,反应条件为:96C2nmin;96C 30s,55C40s,0C4min,30个循环;4C保存 取下密封膜,每孔加人15lL无菌双蒸水和65AL95%乙酵 混合后室温放置15mimn 370wr/min8C 去除上清,离心机中放人吸水纸,96孔板倒置于纸上,快迷离心(不超过1200/mn),加人 离心45min 150L70%乙醇,混合后4000r/nmin8离心15nmin 去除上清,离心机中放人吸水纸,96孔板倒置于纸 上,快速离心(不超过1200r/nin),室温放置5nmin使乙醇挥发,加人10L甲酰胺,9510nmin,立即放人冰 水浴10min，用sanger测序仪测序 注:以上试剂盒均可采用其他等效产品 RR@21是一种TA克隆载体,是Inwitrogen公司提供的产品的商品名 给出这一信息是为了方便本标准的使用者 并不表示对该产品的认可 如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品 14

动物制品中动物源性检测基因条码技术Sanger测序法GB/T35918-2018

动物制品中常见的动物成分包括猪肉、牛肉、羊肉、禽肉等。这些动物源性成分如果在产品生产过程中出现掺杂或者添加不当，会给消费者带来健康隐患。因此，对于动物制品中动物源性的检测显得尤为重要。目前，常用的动物源性检测方法有PCR和基因条码技术。

基因条码技术是一种基于DNA序列信息进行鉴定的技术，可以通过比较不同物种的DNA序列差异性，从而实现对物种的鉴定。Sanger测序法是其中的一种方法，其主要特点是实验方法简单易行，适用于小样本的检测。GB/T35918-2018是国家食品安全标准化技术委员会在2018年发布的《动物源性食品中基因条形码检测方法》标准，该标准规定了基因条形码技术在动物制品中的应用。

根据GB/T35918-2018标准，动物制品中的基因条形码检测应该使用Sanger测序法进行。下面是Sanger测序法的基本步骤：

1. PCR扩增：首先需要将样本中的DNA扩增出来，在PCR扩增过程中引入荧光标记;
2. 纯化：将PCR产物纯化，去掉杂质;
3. 测序反应：将纯化后的PCR产物加入到测序反应体系中进行测序，得到序列信息;
4. 数据分析：通过计算机软件对测序结果进行比对，从而实现对样本物种的鉴定。

总之，动物制品中动物源性检测基因条码技术Sanger测序法GB/T35918-2018是一种可靠、快捷、准确、可复制的检测方法。在食品安全问题越来越引人关注的今天，我们需要不断探索和完善检测技术，保障消费者的健康。

动物制品中动物源性检测基因条码技术Sanger测序法的相关资料

和动物制品中动物源性检测基因条码技术Sanger测序法类似的标准

GB/T35918-2018

动物制品中动物源性检测基因条码技术Sanger测序法

2022/8/20 17:47:23 现行