中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达产品残留DNA检测荧光定量PCR法

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达产品残留DNA检测荧光定量PCR法

国家标准 GB/T34777一2017 仓鼠卵巢(CHo)细胞表达产品 残留NA检测荧光定量CR法 DeteetonofrestdwalDNAinbologtealprduetwhichespresedrom Chinesehasterovary(CHOcell一 Fluorescentquantitativepolymeraseehainreaetionassay 2017-11-01发布 2018-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/34777一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口 本标准起草单位:;信达生物制药(苏州)有限公司、测试技术研究院生物研究所 本标准主要起草人:孙左宇、周李华、李雪峰,黄晓刚,袁志军、郭燕红
GB/34777一2017 仓鼠卵巢(CHo)细胞表达产品 残留DNA检测荧光定量CR法 范围 本标准规定了检测残留宿主DNA的荧光定量PCR法 本标准适用于CHO(仓鼠卵巢细胞)宿主细胞系表达的生物制品的残留宿主DNA的检测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 Ct值eyclethreshold 每个反应管内荧光信号达到设定阔值时所经历的循环数 缩略语 下列缩略语适用于本文件 CHO仓鼠卵巢(ChineseHamsterOvary 原理 5 以真核细胞基因组中具有高拷贝数的16SrRNA为目的基因,设计特异性扩增该基因的PCR引 物,包括正向引物;ForwardPrimer(5'-CCAGGCATTGGTGGCAC-3'和反向引物;ReversePrimer 5'-AGACAGGGTTTcTCTGT-3') 采用sYBR荧光定量PCR(FQ-PCR)法,采集荧光绘制出的PCR扩增曲线Ct值,与扩增体系中起 始目的基因模板的对数值呈反比以起始模板DNA对数值为纵坐标,Ct值为横坐标,制作标准曲线 根据标准曲线方程计算样品的DNA残留量,从而达到定量检测样品残留DNA的含量目的 仪器设备 6.1荧光定量PCR仪;含有SYBR荧光染料检测通道 6.2紫外-可见分光光度计;波长范围;200nm~760 nm 23000 6.3微型离心机:转速范围:2000r/min~ r/min
GB/T34777一2017 6.4电热恒温水浴锅;室温至100C;温度波动范围;士0.5C;温度显示精度;0.1C 6.5生物安全柜/超净工作台 试剂或材料 除非另有说明,本方法中仅使用分析纯试剂,水为G;B/T6682规定的一级水 试剂盒的组成与相 关试剂的配制方式参见相应的厂家说明书 7.1基因组提取试剂盒 7.2基因组纯化试剂盒 7.3DNA提取试剂盒 7.4引物;PCR正向引物;ForwardPrimmer(5'-CCAGGCATTGGTGGCAC-3'合成PAGE级); PCR反向引物;ReversePrimer(5'-AGACAGGGTTTCTCTGT-3'合成PAGE级) 7.5限制性内切酶;EcoRI 7.6DNA标准品 7.7染料法荧光定量试剂盒 7.8蛋白酶K(ProteinaseK 7.9异丙醇(AR) 7.10无水乙醇(AR) 8 试验步骤 8.1DNA提取 8.1.1待测样品残留DNA的提取制备 用超纯水将待测样品稀释至蛋白浓度为1mg/mL20mg/mL,取100L稀释后的样品,参照 DNA提取试剂盒的说明书,进行残留DNA的提取 8.1.2阳性对照样品DNA的提取制备 用超纯水将待测样品稀释至蛋白浓度为1mg/ml20mg/mL,取100AL稀释后的样品,加人20L 00pg/mL的DNA标准品,参照DNA提取试剂盒的说明书,进行残留DNA的提取 8.1.3阴性对照样品DNA的提取制备 用待测样品所对应的制剂缓冲液作为样品,参照8.1.1的方法进行相同倍数的稀释后,取1004L稀 释后的样品,参照DNA提取试剂盒的说明书,进行残留DNA的提取 8.2PCR扩增检测 8.2.1DNA标准品工作液的制备 取DNA标准品,分别稀释至100ng/mL、,10ng/nmlL、1ng/ml、,100pg/ml,10pg/ml,lpg/mL和 0.1pg/mL等系列浓度,用于标准曲线的制备 8.2.2Real-timePCR条件及体系 按表1进行反应体系的配制,各样品制备3个复孔,加样过程先将除DNA模板(即供测试的样品) 以外的各组分预混合,16L/孔,最后加人标准品/待测样品/阴性对照/阳性对照DNA9AL孔,加好
GB/34777一2017 后盖紧盖子,将PCR96孔板或8联管于台式离心机中瞬时离心,使混合液集中于底部 放人PCR仪 的抽屉 表1PCR扩增体系 体系组分 样品量 PremixEx(2× 12L CR正向引物.PCRForwardPrimer(F',10Hmol/L) 1Al PCR反向引物:PCRReversePrimer(R',10Mmol/L 1"l 超纯水(不含核糖核酸 1.6Al ROX参比荧光染料;ROxReferenceDye(50× 0.4Al NA模板(即供测试的样品 9nl 对于不同试剂盒其扩增效率可能会有较大差异,在检测时应先确保系统适应性符合8.2.4.2的要求,必要时可调 整PCR扩增体系的样品量 8.2.3扩增条件 将制备好的PCR反应体系放人PCR仪的抽屉,按表2的反应条件进行PCR扩增 表2PCR扩增条件 步骤1 步骤2(40个循环 步骤3 预变性 变性 退火 延伸 变性 溶解 变性 溶解 95 95 52 72 95 60 95 60 30s 30s 1min 1min 1min 15s tmin 15s 8.2.4系统适应性要求 有效扩增孔的取舍;根据如下检测数值的取舍标准选择有效孔 8.2.4.1 标准曲线上各数据点复孔,可根据标准曲线线性关系的好坏来判断是否舍去,可舍去明显影响 a 标准曲线相关性(使R'>0.99)的复孔数据 整条曲线上舍去的复孔数不得超过3个; b 阳性对照、待测样品各复孔间检测的Ct值的SD值大于0.5时,且由此计算的DNA残留值在 定量限以上,则该数据应重新检测 8.2.4.2系统适用性要求 扩增效率应在90%~110%; aa b 标准曲线的相关系数R'>0.99; 阳性对照样品中DNA标准品的加样回收率应在50%150% c 阴性对照孔无非特异性扩增(DNA含量应小于或等于1pg/mL) d 8.3结果计算 8.3.1 一般原则 阳性对照中DNA标准品的加样回收率为实际检测到在阳性对照中漆加的DNA标准品的量,除以 在阳性对照中添加的DNA标准品的理论值 阳性对照中检测到的DNA总量减去待测样品中检测得 到的DNA量即为实际检测到添加的DNA标准品的量 由于各样品中提取的DNA体积固定,在计算 过程中直接用浓度表示
GB/T34777一2017 8.3.2阳性对照样品中的DNA标准品加样回收率 阳性对照样品中的DNA标准品加样回收率按式(1)计算: p2 ×100% R 式中: R -DNA标准品加样回收率,%; 阳性对照品中的DNA浓度测定值,单位为皮克每毫升(pg/mL); o 待测样品中DNA浓度测定值,单位为皮克每毫升(pg/mL); 02 加人的对照品DNA的终浓度,为20pg/mL 03 8.3.3待测样品残留DNA含量 待测样品残留DNA含量按式(2)计算， p× (2" p 式中: -待测样品残留DNA含量,单位为皮克每毫克(pg/mg) 待测样品中DNA浓度,单位为皮克每毫升(pg/mL); g -稀释倍数; -待测样品蛋白浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL) g

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达产品残留DNA检测荧光定量PCR法GB/T34777-2017

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是常用的哺乳动物细胞表达系统之一，已广泛应用于生物制品的生产中。由于生物制品可能含有CHO细胞产生的残留DNA，因此需要建立高灵敏度、高特异性的检测方法来保障产品质量和安全性。

一、荧光定量PCR原理

荧光定量PCR是基于聚合酶链式反应（PCR）原理，通过荧光探针实时监测PCR反应产生的扩增产物，从而对靶分子进行定量检测的方法。该方法具有高灵敏度、高特异性、高准确性等优点，已成为生物制品残留DNA检测的首选方法。

二、残留DNA检测方法

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达产品残留DNA检测荧光定量PCR法GB/T34777-2017是一种适用于生物制品残留DNA检测的标准方法。该方法基于荧光定量PCR原理，通过选择高保真度的PCR酶和特异性的引物及探针，实现对CHO细胞产生的残留DNA的快速、准确、高灵敏度检测。

1. 样品处理及PCR反应条件

样品处理包括DNA提取和纯化，PCR反应条件包括荧光探针的使用、PCR酶的选择、引物的设计和PCR反应体系的调整等。具体步骤如下：

1. 将待测样品DNA提取，并进行纯化。提取过程中应注意避免污染。
2. 设计高特异性引物和荧光探针，并优化PCR反应体系。
3. 进行PCR反应，并在荧光检测系统中实时监测扩增曲线。

2. 数据分析

根据荧光定量PCR实时监测数据，可以绘制扩增曲线和标准曲线，计算出样品中的目标DNA含量，最终得到残留DNA的浓度。同时，还需要进行质量控制，确保检测结果的准确性和可靠性。

总的来说，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达产品残留DNA检测荧光定量PCR法GB/T34777-2017是一种快速、准确、高灵敏度的生物制品残留DNA检测方法，能够有效保障生物制品的质量和安全性。

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