T4DNA连接酶酶活及杂质检测方法

T4DNA连接酶酶活及杂质检测方法

国家标准 GB/T34776一2017 T4DNA连接酶酶活及杂质检测方法 T4DNAgas一Detetimethodsfaetityamdimpuritsfenyme 2017-11-01发布 2018-05-01实施 中华人民共利国国家质量监督检验检疙总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/34776一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国工具酶工作组(SAC/SwG1l)归口 本标准起草单位:测试技术研究院、深圳华因康基因科技有限公司、福建华灿制药有限公司 本标准主要起草人:周李华、李怀平、盛司潼、孙登峰、谭辉彪黄发灿,金虹、马丽侠、叶德萍、李花、 王智、沈兴中,谭和平
GB/34776一2017 T4DNA连接酶酶活及杂质检测方法 范围 本标准规定了T4DNA连接酶的活力、杂质的检测方法 本标准适用于作为分子生物学研究用的T4NA连接酶 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 电泳装置 YY/T0087 YY/T0657医用离心机 JG646移液器检定规程 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 DNA连接酶 DNAligase -种封闭DNA链上的缺口酶,借助ATP或NAD水解提供的能量催化相邻的核苷酸分子间3'-羚 基和5'-磷酸基形成磷酸二酯键 注:DNA连接酶催化底物可以是DNA或RNA 依据酶的类型不同,反应中产生高能中间产物的辅助因子可以是 ATP或NAD 3.2 14DNA连接酶T4DNAligase -种T4噬菌体基因30的编码产物,以ATP作为辅助因子,催化双链DNA或RNA的5'-磷酸末 端和3'-胫基末端形成磷酸二酯键 注:带有His-Tag,分子质量约为70ku,来源于转化有T4DNA连接酶表达载体的E.Coli菌株 主要作用是催化 DNA末端之间的连接,修复双链核酸中的单链切刻 3.3 酶活力单位 unmitactivity 在20AL.1×T4DNA连接酶反应缓冲液中,l6C反应条件下,30min能使50%的经Hlind消 化的入DNA片段[5'端浓度为0.12"mo ol/L(300"g/mlL]连接所需的酶量即为1活力单位 缩略语 下列缩略语适用于本文件 erasechainreaction PCR聚合酶链式反应(polyme SDsPAG;E十二烧基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdode sulfatepolyacrylamide eey! gel
GB/T34776一2017 eleetrophresis) Tris三(胫甲基)氨基甲烧(Tris(hydroxymethyl)metylaminomethane). 5 试剂与溶液 除非另有规定,本方法所用的试剂应为不含DNA和DNase的分析纯试剂,所有试剂溶液宜大体积 配制、小体积分装后经高压灭菌后使用,不宜高压灭菌的试剂应用0.224m过滤器过滤除菌;酶缓冲液 应避免反复冻融;水为GB/T6682规定的一级水 5.1氯化钠(NaCI 5.2琼脂粉(Agar) 5.3氢氧化钠(NaOH. 5.4乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA,CHN,O,Na;) 5.5TE缓冲液;10mmol/LTrisCl(pH8.0),1mmol/LEDTA，使用Hcl或Na(oH调节pH 5.6酶贮存溶液;50mmol/I KCl,10mmol/LTris-Cl(pH7.4),0.1mmol/1EDTA,1nmmol/I DT'T,2004g/mlBSA和50%的甘油 5.7 10×T4DNALigaseBuffer:400mmol/LTris-Cl,100mmol/IMgCl,100mmol/LDTT， 5mmol/1ATPpH7.8). 5.850×TAE缓冲液:称取484gTris,量取ll4.2mL冰乙酸,200ml0.5mol/EDTA(pH8.0),溶 于水中,定容至2L 5.910×上样缓冲液:含0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油水溶液 6 主要仪器和设备 6.1电泳系统;应符合YY/T0087的要求 6.2凝胶成像系统 6.3加热制冷水浴/循环器:一20Cl00C 6.4冷冻离心机:可以在4C下进行离心,离心转速10000r/min以上,应符合YY/T0657的要求 6.5微量可调移液器;0.5AL10AL,l0AL100"L,l00ML1000AL,应符合JG646的要求 试验方法 7.1酶活力测定 7.11入DNA-Hind皿底物制备 入DNA-Hind皿按照以下步骤进行制备 按表1配制酶切反应体系 加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁 a 切忌振荡混匀);轻轻混匀,短暂离心 表1酶切反应体系 试剂名称 加样体积 10×酶切缓冲液 40L 入DNA(0.34g/4l) 60Al
GB/34776一2017 表1(续 加样体积 试剂名称 HindI20U/L 10 ddH.O 290Al 总体积 400Al b)37C反应4h 反应结束后向样品管中加人等体积的酚;氧仿:异戊醉(25;24:1),轻轻 摇匀;12000 离心8min 小心地将上清转移到新EP管中,不应吸到下面有机相里的 r/min 液体 加人等体积的氯仿异戊醉(24:1),轻轻摇匀;1200or/nmin离心8min 小心地将上清转移 到新EP管中 加人1/10体积的3mol/L醋酸钠颠倒混匀,再加2倍以上体积的无水乙醇,颠倒充分混匀后 室温放置沉淀 用适量75%~80%乙醉清洗白色沉淀2次 ee 放于超净台轻风将残余乙醇吹干,也可以室温蒸发 f 用适量的TE缓冲液溶解DNA g h)紫外分光光度计和琼脂糖电泳检测DNA浓度和纯度(电泳检测结果条带清晰明亮,无杂带， 范围分布在23130bp~125bp之间 紫外可见分光光度计测定产物的A/A在1.81.9 之间,Am/Am>2 7.1.2T4DNA连接酶活力检测 按表2顺序配制20l连接反应体系,每个梯度设置3个平行 表2酶活力测定反应体系 试剂名称 加样体积 10×T4DNA连接酶反应缓冲液 2Al 底物DNA(一般用入DNA-Hind川片段 lAg daH.O 补齐至204l 分别加人0.0L.0.5ALl.5AL.2.5儿. 参照酶"/待测酶" 总体积 20AL 本标准暂采用NEBT4DNA酶为参照,待有市售T4DNA连接标准品时,可直接替换采用标准品作对照 待测酶用贮存溶液稀释至1U/AlL 酶不得含有杂质污染 构建连接酶的阳性对照组和无酶阴性对照组 加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁,切忌振荡混匀);轻轻混匀,短暂 快速离心,在最适温度下(一般为16C),反应30min,进行电泳(电泳条件参见附录A),观察连接情 况;根据参照酶加人的最小体积乘以稀释倍数计算待测酶活力 具体计算方式可参见附录A 7.2杂质检测 7.2.1核酸内切酶检测 按表3顺序配制连接反应体系
GB/T34776一2017 表3核酸内切酶检测连接反应体系 试剂名称 加样体积 0×T4DNA连接酶反应缓冲液 5A 底物DNA l4g ddH.O 补齐至50al 20U 待测酶 总体积 50L 注:底物DNA可以是pBR322,pUC19,pUC57等 加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁,切忌振荡混匀);轻轻混匀,短暂 快速离心,在最适温度下(一般为37C)连接4h,连接产物进行电泳,根据电泳图谱,判断酶中是否夹杂 有核酸内切酶,如条带清晰,明显、不发生变化,说明无核酸内切酶污染 7.2.2核酸外切酶检测 单链外切脱氧核糖核酸酶检测 7.2.2.1 按表4顺序配制连接反应体系 表4外切酶检测连接反应体系 试剂名称 加样体积 10×T4DNA连接酶反应缓冲液 2AL 单链寡核苷酸ssDNA(50nmt) 200ng ddH.(O 补齐至20Al. 20U 待测槲 总体积 20AL 加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁,切忌振荡混匀);轻轻混匀短暂 快速离心,在最适温度下(一般为30C)连接过夜,反应产物经15%SDS-PAGE电泳检测并成像分析 实验结果 无DNA降解说明无单链外切脱氧核糖核酸酶的污染 7.2.2.2双链外切脱氧核糖核酸酶污染检测 按表5顺序配制连接反应体系 表5外切酶检测连接反应体系 试剂名称 加样体积 10×T4DNA连接酶反应缓冲液 2Ml 双链寡核苷酸dsDNA(50bp 200ng ddH.O 补齐至20l 待测悔 20U 总体积 20Al
GB/34776一2017 加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁,切忌振荡混匀);轻轻混匀,短暂 快速离心,在最适温度下(一般为37)孵育4h,反应产物经15%SDSPAGE电泳检测并成像分析实 验结果 无DNA降解说明无双链外切脱氧核糖核酸酶的污染 7.2.3核酸酶检测 按表6顺序配制连接反应体系 表6核酸酶检测连接反应体系 试剂名称 加样体积 10×T4DNA连接酶反应缓冲液 5AL 底物DNA或RNA 1 Ig -般用入DNA-Hind片段,16s,23srRNA) ddH.o 补齐至50L 待测酶 20U 总体积 50 轻轻混匀,短暂快速离心;最适温度下(一般为37C)连接24h或18h,连接产物进行电泳,带型不 发生变化 如果带型清晰、明显、无变化说明无其他可检测到的核酸酶污染 7.2.4连接效率检测 按表7顺序配制连接反应体系 表7连接效率检测连接反应体系 加样体积 试剂名称 10×T4DNA连接酶反应缓冲液 5Al 底物DNA(入DNA-Hind川,入DNA-HaeI l4g daH.O 补齐至504l 待测酶 20U 总体积 50L 轻轻混匀,短暂快速离心;最适温度下(一般为l6C一22C)连接1h,连接产物进行电泳，>98% 的ADNA-HindW片段被连接或>95%入DNA-Hae皿片段被连接,如果带型清晰说明连接效率高 7.2.5连接-再切检测 按表8,表9顺序配制连接反应体系和酶切反应体系 加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁,切忌振荡混匀);轻轻混匀,短暂 离心在最适温度下(一般为16C一22C),反应1h,进行电泳,然后回收连接后的DNA,溶于内切酶级 冲液中;按表9顺序配制酶切反应体系
GB/T34776一2017 表8连接反应体系 加样体积 试剂名称 10×T4DNA连接酶反应缓冲液 5Al 底物DNA(ADNA-Hind匪.,ADNA-HaeI 144g ddH.O 补齐至50L 待测酶 20U 总体积 50l 表9酶切反应体系 试剂名称 加样体积 10×T4DNA连接酶反应缓冲液 2AL 回收的DNA(5'末端浓度成为0.l4mol/L ~1.0mol/I ddH,O 补齐至20Al. 20U Hindl或Hae川 总体积 20AL 轻轻混匀,短暂离心,最适温度下(一般为37C)酶切4h,酶切产物进行电泳,如果能被内切酶再次 切割,表示识别序列恢复完全,3'和5'末端保持完整 通过以上结果,可以判断是否存在连接酶抑制剂 或磷酸酶以及核酸外切酶等杂质
GB/34776一2017 附 录 A 资料性附录 T4DNA连接酶酶活力计算 酶连接产物凝胶电泳检测 A.1 取0.8g琼脂糖,于100mL电泳缓冲液中加热,充分溶化,加人潦化乙锭(10mg/mL)至终浓度为 0.54g/mL,制胶 在电泳槽中加人电泳缓冲液,使液面刚刚没过凝胶 将5AL一8L酶连接产物分 别和适量加样缓冲液混合,点样 9V/em恒压电泳,直至澳酚蓝指示剂迁移至凝胶中部 紫外检测仪 下观察电泳结果并记录 A.2酶活力计算 参照酶稀释400倍 待测酶稀释1200倍 M入DNA0.20.30.50.81.01.52.02.50.20.30.50.81.01.52.0 2.5 单位山 10b 5Ab 4kb 3kb 2kb 1kb 图A.1待测酶活力检测电泳图谱 从图A.1可以看出,稀释1200信的待测酶与稀释400倍的参考酶同一酶量的连接反应产物相同 即酶话力相当 因参照酶活力为5wtisw/lL.计算稀释倍数后,得出待测雕的解话力为15wts/L..即 3000CEU/L

T4DNA连接酶酶活及杂质检测方法GB/T34776-2017

T4DNA连接酶是一种重要的连接酶，在DNA克隆和PCR扩增等实验中得到了广泛应用。T4DNA连接酶通过连接两个DNA分子，可以构建出大片段的DNA，还可以在连接过程中修复受损的DNA链。因此，准确检测T4DNA连接酶的酶活和杂质含量对于保证实验结果的准确性至关重要。

一、T4DNA连接酶酶活检测方法

T4DNA连接酶酶活检测方法是通过测定T4DNA连接酶连接反应后形成的连接产物来确定酶活的高低。具体步骤如下：

1. 将T4DNA连接酶按照说明书稀释至适当的浓度。
2. 加入适量的连接底物（一般为线性化的质粒DNA）和缓冲液，进行连接反应。
3. 将连接产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，并用紫外线照射可见DNA条带。
4. 根据连接产物的相对迁移率（Rf值）计算出T4DNA连接酶的酶活。

二、T4DNA连接酶杂质检测方法

T4DNA连接酶杂质检测方法是通过比较T4DNA连接酶连接反应前后样品中DNA含量的变化来确定杂质的含量。具体步骤如下：

1. 将待测样品加入适量的连接底物和缓冲液，进行连接反应。
2. 在连接反应之前和之后，分别取出一部分反应液，通过琼脂糖凝胶电泳分离，并用紫外线照射可见DNA条带。
3. 比较两个样品的DNA条带强度，如果差异较大，则说明存在较多的杂质。

综上所述，T4DNA连接酶酶活及杂质检测方法GB/T34776-2017是一种简单、快速、准确的检测方法，可以为实验研究提供重要保障。

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