GB/T34796-2017
水溶液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法
Quantificationandpurityanalysisofnucleicacidconcentrationinsolution—Ultravioletspectrophotometry
- 中国标准分类号（CCS）A40
- 国际标准分类号（ICS）07.080
- 实施日期2018-05-01
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
- 文件大小497.76KB
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水溶液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法
国家标准 GB/T34796一2017 水溶液中核酸的浓度和纯度 检测紫外分光光度法 Quantificationandpurityanalysisofnueleicaeidconcentrationinm solution一Ultravioletspectrophotometry 2017-11-01发布 2018-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/34796一2017 水溶液中核酸的浓度和纯度 检测紫外分光光度法 范围 本标准规定了使用紫外分光光度法检测水溶液中核酸的浓度和纯度的原理、样品制备及检测方法
本标准适用于水溶液中核酸的浓度和纯度检测,可对浓度在5ng/AL及以上的水溶液核酸样品定 量检测和纯度分析
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T11165实验室pH计 GB/T26813双光束紫外可见分光光度计 JG646移液器检定规程 缩略语 下列缩略语适用于本文件
DNA;脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) RNA:;核糖核酸(ribonucleicacid 原理 核酸中喋岭和密唁碱基有共轭双键,具有吸收紫外光的性质,其最大吸收值在波长为250nm 270nm之间
碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不会改变,最大吸收波长约260nm,吸收 在波长260nm处,1单位oD值的光密度相当于双链DNA浓度为504g/mlL、单链 低峰在230nm
DNA及RNA为404g/mL、单链寡核苷酸为334g/mL,利用此量和浓度关系,可用于计算核酸样品 的浓度
试剂和材料 除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 5.1DNA标准溶液 小牛胸腺DNA标准溶液
5.2三羚甲基氨基甲炕缓冲液(1mol/LTris-lHCI,pH7.4 称取121.1gTris置于1L烧杯中,人800mL去离子水,充分搅拌溶解,用NaOH调节pH值，
GB/T34796一2017 定容至1L,分装后在103kPa(1.05kg/cm')高压燕汽灭菌20min,室温保存,备用
5.3EDTA(500mmol/L,pH8.0 称取186.1gNaeEDTA2H.O,置于1L
烧杯中,加人约800ml的去离子水,充分搅拌,用 NaOH调节pH至8.0pH至8.0时，EDTA才能完全溶解),定容至1L,分装后在103kPa 1.05kg/cm=)高压蒸汽灭菌20min,室温保存,备用
5.4TE缓冲液(10×TEButrer,pH7.4) 量取100mL1mol/ITris-HCl(pH7.4),20mL500mmol/几EDTA(pH8.0)置于11烧杯中 加人800ml去离子水,混合均匀,定容至1L,分装后在103kPa(1.05kg/em=)高压蒸汽灭菌20min. 室温保存,备用
6 主要仪器,设备 6.1紫外分光光度计或核酸蛋白测定仪,应符合GB/T26813的要求
6.2漩涡器
6.3电子天平:精度分别为0.lmg、0.01mg
6.4pH计,0.1级,应符合GB/T1ll65的要求 6.5可调移液器:0.5AL10AL、10AL100AL、100从Ll000!L,应符合JG646的要求
样品制备 将适量核酸样品溶解于无菌水或TE溶液中,稀释至工作曲线范围内供测定 吸光度检测核酸浓度和纯度 8 8.1仪器设置条件和程序 8.1.1核酸浓度检测 检测波长:260nmm
8.1.2核酸纯度检测 nm230nm、280nm.
检测波长;260 8.2测定 取适量核酸溶液(溶液体积根据仪器要求)检测.以稀释溶液调零,根据波长260nm、230nm、 280nm处核酸的吸光度,计算DNA双链、DNA单链和RNA的浓度,根据OD/OD和OD OD比值判断核酸纯度
重复测定3次取平均值
核苷三磷酸的特性参见表A.1及纯化的DNA的 分光光度测定结果参见表B.1
8.3结果计算 8.3.1核酸浓度检测结果计算 核酸浓度按照以下公式计算
GB/34796一2017 核酸样品摩尔浓度含量按式(1)计算 式中 -样品浓度,单位为摩尔每升mol/L); A 吸光度; 波长依赖的摩尔消光系数,单位为升每摩尔厘米[L/molcm)] 光程,单位为厘米(em)
样品的质量浓度按式(2)计算 b p=OD×B 式中: -样品浓度,单位为克每升(g/L); OD; 光程为1cm时在260nm波长下的吸光度值,单位为每厘米(em-'); 平均消光系数[(g/ml)'.cm-门
B 注:对于大分子核酸来说.其浓度计算时可采用平均消光系数
对于较小的寡核苷酸,可根据式(3)由碱基组成精 确计算出摩尔消光系数,再根据式(2)计算寡核苷酸浓度
E=A(15.3十G(11.9)十C(7.4十T(9.3) 式中 E 毫摩尔消光系数(寡核苷酸的浓度一般以mnmol/儿表示) A,G、C、T -寡核苷酸序列中每个核酸的个数
8.3.2核酸纯度检测结果判断 样品纯度根据式(4),式(5)计算,按照表1进行判断 ODa X三 oD y-光 吸光度法检测核酸纯度结果判断表 检测结果 样品类型 X值 Y值 纯DNA理论值为大于2.0，表明有小于1.6表明有蛋小于2表明有前盐、硫酸盐或 DNA样品 1.8 RNA污染 白质污染 其他有机化合物污染 纯RNA理论值为大于2.0,表明有异小于1.7,表明有蛋小于2表明有盼盐、硫缸酸盐或 RNA样品 2.0 硫氮酸残存 白质污染 其他有机化合物污染 扫描吸收光谱检测核酸浓度和纯度 g.1仪器设置条件和程序 检测波长;220nm一340nm范围内全波长扫描,并设置报告260nm值、280nm值、,ODm/ODi、 OD/OD.比值
GB/T34796一2017 9.2测定 g.2.1仪器调零 340 取适量稀释溶液溶液体积量根据仪器要求而定),在220nm nm范围内扫描,调仪器基线 调零 g.2.2样品检测 取适量核酸溶液或标准溶液(溶液体积量根据仪器要求)检测，显示吸收光谐图,读取260nm值、 280nm值,ODm/OD;n,OD/OD;比值,重复测定3次取平均值
较纯的核酸紫外吸收光谐扫描图 参见图C.1
9.3结果计算 9.3.1核酸浓度检测结果计算 仪器自动读取
9.3.2核酸纯度检测结果计算 按9.2.2中oD.m/OD.m.OD.m/oD.及结合表1判断纯度
GB/34796一2017 附 录 A 资料性附录 核苷三磷酸的特性 核苷三磷酸的特性见表A.1
表A.1核苷三磷酸的特性 em×10 280/260吸收比 核苷三磷酸 A.(pH7心) A(GoH7.D" 碱基的pKa饥 pH7.0) G7.D7 ATP 259 227 0,15 5.4 4.0 CTP 0.97 12.8 271 249 4.8 GTP 252 223 13.7” 0.66 3.3 UTP 262 230 10.0 9.5 0.38 226 dATP 259 15.4 0.15 3.6 dCTP 28o 3.l 0,.98 4.3 dGTP 253 222 13.7 0.66 3.5 dTTP 267 9.6 0.73 9.3
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水溶液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法GB/T34796-2017
一、背景介绍
核酸是生命体中存储遗传信息的基本分子，它的浓度和纯度对于生物学和化学研究具有重要意义。因此，准确地测量核酸的浓度和纯度是科研工作者必须掌握的技能。
二、实验原理
紫外吸收光谱法是测定核酸的浓度和纯度的常用方法之一。核酸分子中含有大量的吸收紫外线的芳香族碱基，如腺嘌呤、胸腺嘧啶等，这些芳香族碱基的吸收在260nm处有一个最大值。因此，通过测定核酸分子在260nm处吸光度的大小，可以推算出核酸的浓度和纯度。
三、实验步骤
- 制备样品：将待测的核酸样品溶解在去离子水中或者高盐缓冲液中，并用1cm厚度的石英比色皿装入适量的样品液。
- 进行测量：使用紫外分光光度计，在260nm处测定样品的吸光度值。如果需要测定核酸的浓度和纯度，还需在280nm处测定样品的吸光度值。
- 计算结果：根据所测得的吸光度值，可按照以下公式计算核酸的浓度和纯度：
- 核酸浓度（ng/μL）= A260×稀释倍数×50
- 核酸纯度= A260/A280
四、实验注意事项
- 操作前要彻底清洗石英比色皿，以免污染样品。
- 为了保证测量的准确性，应对紫外分光光度计进行定标，并选择合适的比色皿厚度。
- 在实验过程中，应避免将核酸样品暴露在紫外光下太久，以免影响测量结果。
五、总结
紫外分光光度法是一种简单、快速、准确的测定核酸浓度和纯度的方法。在实际应用中，需要根据样品特性和实验要求选择合适的比色皿和浓度范围，并注意操作过程中要保持实验环境的清洁和稳定。通过本文介绍的方法，可以精确地测定水溶液中核酸的浓度和纯度。这对于生物学、医学、分子生物学等领域的研究有着重要的意义。
