GB/T35535-2017
大豆、油菜中外源基因成分的测定膜芯片法
Detectionofgeneticallymodifiedcomponentsinsoybeanandcanola—Membrane-basedgene-chipmethod
- 中国标准分类号（CCS）A40
- 国际标准分类号（ICS）07.080
- 实施日期2018-07-01
- 文件格式PDF
- 文本页数18页
- 文件大小1,020.40KB
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大豆、油菜中外源基因成分的测定膜芯片法
国家标准 GB/T35535一2017 大豆、油菜中外源基因成分的测定 膜芯片法 canola Deteetionofgenetiealymodiielcompomentsinsybeanamd Membranebasedgenc-chipmethod 2017-12-29发布 2018-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35535一2017 大豆、油菜中外源基因成分的测定 膜芯片法 范围 本标准规定了膜芯片法检测大豆,油裳中外源基因成分的防污染措施,抽样与制样,原理,试剂与标 准品、仪器与设备、试验方法和流程、结果判断、确证实验、结果表述
本标准适用于大豆、油菜中外源基因成分的定性检测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法 SN/T1204 缩略语 下列缩略语适用于本文件
AminolinkerC6;6个碳原子作为连接臂的氨基标记(C6Aminolinker) BAR:草丁瞬乙酰转移酶基因(phosphinothrieinacetylatransferasegene BARNAsE;来源于解淀粉芽抱杆菌(Bacillusamyoliquefaciens)的编码核糖核酸酶的基因 Baeiusamyloliquefaeiensribonucdleasegene) BARsTAR;来源于解淀粉芽袍杆菌Bacilusamyloligueaciens:)的编码核糖核酸酶抑制物的基 因(inibitorofBacillusam1yloliqueaciensribonucleasegene) CaMV35S-P;来自于花椰菜花叶病毒的35S启动子(35Spromoterfromcauliflower mosaicvirus) CaMV35S-T:来自于花椰菜花叶病毒的35S终止子(35Sterminatorfromcauliflowernmosaic VIruS Cry1Ae:苏云金芽抱杆菌杀虫毒蛋白crylA(e)基因[Bacillasthuringiensislnseeticidaltoxin cry1Acgene dATP:脱氧腺昔三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate) dCTP脱氧胞苷三磷酸deoxyeytidinetriphosphate) dGTP.脱氧鸟背三瞬酸(doywunosinetiphosphate) dTTP;脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate)
GB/T35535一2017 dUTP;脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridinetriphosphate) EPSPS;5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(5-enolpyruvylshikimate-3phosphatesynthase gene FMV35S-P:玄参花叶病毒35S启动子(35Spromoterfrom figwort mosaicVirus GAT4601;草甘腾乙酰转移酶基因glyphosateacetyltransferasegene) Gox,草甘脚氧化还原酶基因(elyphaosatec oxidoreductasegene Leetin;凝集素基因(leetingene) NC阴性对照(Negativecontrol N(O)S-3':胭脂碱合成酶基因终止子(terminatorofthenopalinesynthasegene NPT-l;新霉素-3-磷酸转移酶基因(neomyeinphosphotransfe erasegene PAT;草丁脚乙酰CoA转移酶基因(phosphinothrieinacetyltransferasegene) PC:阳性对照(Positivecontrol uvatecarboxylase PEP,磷酸熔醉式丙围酸拨化酶基因(hophoenolpyu gene Taq:TherwsAguaticusDNA聚合酶(ThermusAguaticusDNApolymerase) UDG酶:尿啼哧-N-糖基化悔(UracilN-glycocasylase 防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施应按照GB/T19495.2的规定执行 抽样与制样 5 应符合GB/T19495.7的相关规定
原理 待检样品经DNA模板提取和核酸定量,采用多重PCR扩增体系,扩增其中可能含有的转基因大 豆、油菜中常见外源基因特异性扩增序列
PCR扩增产物与固定有目标外源基因特异性探针的膜芯片 进行杂交后,检测结果可以用肉眼直接判断,或用芯片识读仪对杂交芯片进行扫描并判定结果
试剂与标准品 7.1总则 除非另有规定,本方法中所用试剂均为分析纯,水应符合GB/T6682三级水的规定
7.2试剂组分 本标准中试剂组分和存放条件参见附录A和7.37.5的规定
7.3引物 大豆PCR反应使用的引物序列应符合表1的规定、油菜PCR反应使用的引物序列应符合表2的 规定
GB/35535一2017 表1大豆PCR反应使用的引物序列 扩增片段大小 目标基因 引物名称 序列 bp 5'-GC(GCGATCATACG(GAAAAGAT-3 Forward EPSPS 123 Reverse 5'-biotin-TCGATGACTTGGCCGGTGAG-3' Forward 5'-AGAAACAGTACCAGCTCCGA-3 GAT46o1 151 Reverse 5" '-biotin-TAGCCTGAGiGiCGGATG;TcCTC-3 Forward 5'-TACTGCAACACTCGAGGCTG3" Cry1Ac 190 Reverse 5'-biotin-TTTCTCGGACAATTCTCGCT-3 5'-TGATATGGccGcGGTTTGTGAT-3 Forward PAT 180 5'-biotin-(GGCcCAGcGTAAGCAATAcC-3' Reverse Forward 5'-AGTcCAAAGcCTCAACAAGG3' FMV35SP 168 Reverse 5'-biotin-CcCACTAACTTTAAGTCTTCGGTG3" Forward 5'-GAAGATGCCTCTGCCGACAG3" CaMV35S-P 106 Reverse 5'-biotin-ATCAATCCACTTGCTTTGAAGACG3 Forward 5'-CCAGATAAGGGAATTAG(GGTTC-3 CaMV35S-T 132 -3 5'-biotimAcTGGATTTIGGTTTAGGAATTAGA- Reerse 5'-C'T(TTG(Cc(G(GTcTTGc(GAT-3' Forward NOS3 177 Reverse 5'-biotin-TTTATCCTAGTTTGCGCGCT3" Forward 5'-AAGTTGAAAACCCAGAATGTGG-3 Lectin 134 Reverse 5'-biotin-TTTGGTTG;CTTCGGCACGAA3 表2油菜PCR反应使用的引物序列 扩增片段大小 目标基因 序列 引物名称 bp Forward 5'-(GTCCGTATTCCAGGTGACAA-3 EPSPS 156 Reverse 5'-biotin-TTCCTTACGGATTCTGGCAC-3 5'-ACTGGAAGCGTGCTCACGTT-3 Forward GoX 200 Reverse 5'-biotin-ACCAGTCATACCGAGGTGAC3 Forward 5'-ACAGTGAACTTTAGGACAGAGC-3 PAT 126 5'-biotin-AGcGTAAGCAATAccAGccA-3 Reverse 5'-GCAGGATcTccTGTcATcTc3' Forward NPT-I 190 Reverse 5'-biotin=ATGcTcTTcGTcCAGATCAT-3 Forward 5'-CGTCTGCGGGAGCGCTATcC-3" BAR 168 5" Reverse '-biotin-GTAGAGCGTGGAGCCCAGTC-3 Forward 5'-GGATTTCCGTTTGTTTACTGGTGC-3 BARNASE 146 Reverse 5-biotin-TGTCTGAAGATAATCCGCAACC-3
GB/T35535一2017 表2续) 扩增片段大小 目标基因 引物名称 序列 bp 5'-AT(GGGATTGTcCTGACcGGAT-3" Forward BARSTAR l18 Reverse 5'-biotin-TTCACGGAAAACCTGAAGCA-3' 5'-AGTCCAAAGCCTCAACAAGG-3 Forward FMv35sP 168 Reverse 5'-biotin-CcCACTAACTTTAAGTcCTTCGGTG;-3 Forward 5'-GGCCATCGTTGAAGATGCCTC-3 CaMV35S-P 144 Reverse 5'-biotin-TCATCCCTTACGTCAGTGGA-3 5'-cCAGATAAG;G;GAATTAGGGTTC3' Forward CaMV35ST 132 5'-biotin-AcTGG;ATTTTGG;TTTTAGG;AATTAGA-3 Reverse Forwardl 5'-cCTGTTGccGGTcTTGcGAT-3" NOS3 177 Reverse 5' '-botin-TTTATCCTAGTTTGCGCGCT3 Forward 5'-CAACTACCAATACACATCGAGTGG-3 PEP 123 Reverse 5'-biotin-GGTCGAGAAGTTTCTTTCACGAGG;-3 7.4探针 膜芯片表面包被的目标基因探针序列大豆应符合表3的规定、油菜应符合表4的规定
表3大豆目标基因探针序列 名称 修饰基团 5'-ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCCGCCTGGAAGG EPSPS -AminolinkerC6 CCGC(GGC-3 5'-AGTTAAAcAcGCTGAAGAAATccTTcGTAAGAGGGGGGcGGAcATGcTTTG GAT4601 I5'-AminolinkerC6 GTGTAAT(G;3 5'-ATATTGATcAAGTGTccCAATTTAGTTAcGTATTTATcGGATGAATTTTGTc CrylAe -AminolinkerC6 TGGATGAA-3 -ATCTAGAGAGGTTGCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGG PAT -AminolinkerC6 GTGTTGTG38 5'-CAAAGTAAACTACTGTTCCAGCACATGCATCATGGTCAGTAAGTTTCAGAA FMV35S-P -AminolinkerC6 AAAGAcAT-3' 5'-G;TccCAAAGATGGAcccccAcccAcGAGGAGcCATcGTGGAAAAAGAAGAcG CaMV35s-！ 5'-AminolinkerC6 TTCCAACC3' 5'-AGCATATAAGAAACcCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATcC aMV35ST -AminolinkerC'6 AATAAAAT-3" 5-ATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCG NOS3" -AminolinkerC6 ATAGAAAA-3"
GB/35535一2017 表3(续) 序 修饰基团 名称 5'-CTGGTGCTACTGACCAGCAAGGCAAACTCAGCGGiAAACTGTTTCTTTCAGCT Leetin -AminolinkerC6 GGAACAA-3 5'-GcATccAGATcAGAAGcAATAATGAGCAGTGcGAGAAGAAcGAGTGTccAA PC AminolinlkerC6 AGTAcCAG;3' 5'-GG;TTccTTGAGAAATG;TTTTAcG;GG;ATTAcTTccATGTTTG;TTGGATGATcc Nc -AminolinkkerC TATTTTC-3 表4油菜目标基因探针序列 名称 序 列 修饰基团 5'-TATCACCGGTCTTTTGGAAGGTGAAGATGTTATCAACACTGGTAAGG EPSPS AminolinkerC6 CTATGCAAGCTA-3" 5'-(CCCTTCCAGTG;ATTGGTCGTGCTACCCGTACTCCAGACGTTATCTACG GOX AminolinkerC6 CTTTCGGTCAC-3 5'-GGATTGATGATcTAGAGAGGTTGcAAGATAGATAcccTTGGTTGGTT PAT 5'-AminolinkerC6 GcTGAGGTTGAG;3 5'-CACCAAGCGAAACATC(GCATCGAGCGAGCACGTACTC(GGATGGAAGCC AminolinkerC6 NPT-II GGTCTTGTCGA-3 5'-CGCAACGCCTACGACTGGACGGCCGAGTCGACCGTGTAcGTCTCCCCcC BAR -AminolinkerC6 GCCACCAGCG3 5 '-AAcGGAAACATcTTcTcAcAAGGCAcACACAGAAGcAcAGGTTATcA BARNAsE -AminolinkerC6 AcAcG;TTTGAcG;3 5'-CG;TTTGG;AATGG;AGGCAG;TTTGAACAAAGCAAGcAGcTrGAcTG;AAA BARSTAR AminolinkerC6 ATGGcGcCGAGA-3" 5'-CAAAGTAAACTACTGTTCCAGCACATGCATCATGG:TCAGTAAGTTTC FMV35S-P AminolinkerC6 AGAAAAAGACAT-3 5'-AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCA ICaMV35SP -AminolinkerC6 AGTGGATTGATG3" -AGcATATAAGAAAcccTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATAcTTc CaMV35s1 AminolinkerC6 TATcCAATAAAAT-3" 5'-ATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTcCcGCAATTATACATTTAATA NOS3 AminolinkerC6 CGCGATAGAAAA-3 5'-(GAGATTTTTCCAAGGCTTCAAACTCTTTCATCACATGTCTCTTCTC'TT PEE 5'-AminolinkerC6 TCCATTGTCTT-3"
GB/T35535一2017 表4续) 名称 序 列 修饰基团 5'ccATccAGATcAGAAGcAATAATGAGcAGTGcGiAGAAGAAcGAGTGT P( 5'-AminolinkerC6 CCAAAGTAcCAG3" 5'-GGTTccTTGAGAAATGTTTAcGGGATTACTTcCATGTTTGTTGGAT N 5'-AminolinkerC'6 GATcCTATTTTC3' 注;阳性寡核背酸单链DNA(Positive-oligo,10mol/L);核背酸序列与阳性对照核酸探针(PC)序列互补,用于 膜芯片杂交过程质量控制,5'端带生物素(biotin)标记,序列如下 5'-biotin-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3 7.5其他试剂 7.5.1氢氧化钠(NaOH
7.5.2氯化钠(NaCI 7.5.3磷酸二氢钠(NaH,POH.O). 7.5.4乙二股四乙酸二钠(EDTA2Na). 7.5.5 十二炕基磺酸钠(SDS) 7.5.6碱性磷酸酶标记链霉亲和素(APstreptavidin) 7.5.7碱性磷酸酶化学显色底物5-嗅-4-氯-3-呵嗓磷酸和氯化硝基四氮陛兰(NBT/BCIP) 7.5.8多重PCR即用型预混液(MultiplexPCRMasterMix)
7.5.9多重CR引物预混液(MultiplexPCRPrimerMix),每条引物2mol
7.5.1020×SSPE缓冲液:3molNaCl,200mmv nolNaH.PO，20mmolEDTA，pH7.4 7.5.11去活化液:100mmolNaOH 7.5.12去活化清洗液:2xssPE.0.1%sDs 7.5.13杂交液;2xssPE.0.1%sDs 7.5. 14 杂交清洗液;2xssPE,0.5%sDs 7.5.15酶孵育液:2xssPE.0.5%SDs 7.5.16孵育清洗液1:2XssPE.0.5%sDs 7.5.17孵育清洗液2;2×sSPE /mLBCIP,0.30 mg/mlNur 7.5.18底物显色液;碱性磷酸酶化学显色底物NBT/EBCIP,含0.15mg/ 100mmol/LTris-HC，5mmol/LMgCl，pH9.5
7.5.19膜芯片耗材:尼龙膜,BiodyneC型号,厚度0.45pm. 7.6标准品 7.6.1A2704-12转基因大豆标准品;包含PAT,CaMV35S-P,CaMV35s-T转基因成分
7.6.2DP356043转基因大豆标准品:包含GAT4601转基因成分
7.6.3GTS40-3-2转基因大豆标准品;包含EPSPSs,CaMV35S-P,NOs3'转基因成分
7.6.4 MoN87701转基因大豆标准晶包含CylAc转基因成分 7.6.5MON89788转基因大豆标准品:包含EPSPs,FMV35s-P转基因成分
GB/35535一2017 7.6.6GT73/RT73转基因油菜标准品;包含EPSPS,GOX,FMV35S-P转基因成分
7.6.7Msl转基因油菜标准品;包含NPT-I,BAR,BARNASE，NOs3'转基因成分
7.6.8Rf2转基因油菜标准品:包含NPT-II,BAR,BARSTAR，NOS-3'转基因成分
7.6.9To ropas19/2转基因油菜标准品;包含PAT,NPT-,CaMV35S-P,CaMV35sT转基因成分 7.6.10Non-ModifiedSoybean非转基因大豆标准品 7.6.11Non-ModifiedCanola非转基因油菜标准品
8 仪器与设备 8.1基因扩增仪;升降温速度>1.5C/s,孔间温度差异<1.0C
8.2核酸微量分光光度计
8.3纯水仪
8.4分析天平;准确到0.001g
8.5芯片识读仪300dpi
8.6台式离心机:转速12000r/min 8.7分子杂交炉;37C一60C,士0.5C
8.8芯片自动杂交仪:37C60C,士0.5C 试验方法和流程 9.1膜芯片法检测流程 膜芯片法检测流程参见附录B. 9.2样品 9.2.1实验室样品代表性应符合GB/T19495.7的规定
9.2.2标准品、实验室样品及测试样品的保存应按照GB/T19495.1的规定执行 g.2.3所有测试样品的制备操作应按照GB/T19495.2的规定执行
9.3样品制备 9.3.1DNA的提取 样品中DNA的提取,应按照GB/T19495.3中的规定执行,或采用同等功能的植物基因组DNA 提取试剂盒
每个测试样品提取时应做两个提取重复
9.3.2PCR扩增 将9.3.1的核酸提取物加人到PCR反应体系进行扩增
9.3.3PCR反应体系 按照表5,表6配制PCR反应体系
每次实验中,利用转基因大豆、油菜标准品的基因组DNA作 为阳性质控,非转基因大豆、油菜标准品的基因组DNA作为阴性质控,用缓冲液或水代替样品进行核 酸提取作为空白质控,以对后续的PCR扩增体系、膜芯片杂交反应进行质控
GB/T35535一2017 表5CR反应体系体积(50L) -大豆 反应液组成 检测反应 阳性质控 阴性质控 空白质控 MultiplexCRMasterMix 25AL 25 25AL 25nL AL MultiplexPCRprimerMix 8Al 8AL 8l 8Al 检测样品基因组DNA 200ng 转基因大豆标准品基因组DNA 200ng 非转基因大豆标准品基因组DNA 200ng 核酸提取空白 10Al 无核酸灭菌水 补水至50L 补水至50A 补水至50L 补水至50L aANP.P 注;PCR体系最终含有MgCl1 ,dGTIP,dTTP和dUTP各 0.2mmolL.UDG酶1U. l.5mmmol/I,d K mol/L ru酶2U,大豆引物序列中每条引物0.21 表6PCR反应体系体积(50pL) -油菜 反应液组成 检测反应 阳性质控 阴性质控 空白质控 MultiplexPCRMasterMix 25Al 25pl 25Al 25l. l1Al MultiplexPCRprimerMix 1lAl 11AL 1ll 检测样品基因组DNN 200ng 200 转基因油菜标准品基因组DNA ng 非转基因油菜标准品基因组DNA 200ng 核酸提取空白 10Al 无核酸酶灭菌水 补水至50l. 补水至50AL 补水至50AL 补水至50l. 注PCR体系最终含有Mg(C l.5mmol/L，dATP,dcTP,dGTP,dlTTP和dUTP各 0.2mmol/I， UDG酶1U. Taq酶2U,油菜引物序列中每条引物0.2mol/I 9.3.4PCR反应循环参数 按照表7设计PCR反应参数
表7PCR反应参数 步骤 温度 反应时间 37C 10min 95C l0min 95C 30s 55 C 30s 72C 30s 3、4、5循环40次 72 10min 7(推荐 保温
GB/35535一2017 9.4膜芯片杂交 g.4.1膜芯片制备 膜芯片制作和质量控制参见附录C
9.4.2杂交体系 按照表8配制杂交体系液
表8杂交体系 组 分 体积/Al 杂交液(2×SSPE,0.1%SDS 979 PCR扩增产物 20 阳性寡核苷酸单链DNA(Positive-(Oligo,l104mol/L 总体积 1000 9.4.3酶孵育体系 按照表9配制酶孵育体系液,使用时重新配制
表9酶孵育体系 体积/ 组 分 孵育液(2×SSPE,0.5%SDS) 999.5 碱性磷酸酶标记链霉亲和素(APstreptavidin 0.5 总体积 1000 g.4.4杂交,酶联及显色 g.4.4.1杂交检测方式 本步骤有手动操作和自动杂交仪测定两种选择
9,4.4.2手动过程 将膜芯片置于杂交盒内,按表10进行手动杂交
杂交过程在分子杂交炉中进行,类似仪器应满足 实验要求
表10膜芯片手动杂交过程 过程名称 步骤 加人去活化液1ml,37C,8min,吸除去活化液 去活化 去活化清洗 加人去活化清洗液1ml.,60,5min,吸除去活化清洗液 杂交 加人杂交体系液1ml,42C,45min,吸除杂交体系液
GB/T35535一2017 表10(续) 过程名称 步骤 杂交清洗(2次) 加人杂交清洗液lml,52C,5min,吸除杂交清洗液,该过程重复2次 酶孵育 加人酶孵育体系液1ml,42C,30min,吸除酶孵育体系液 孵育清洗1(2次)加人孵育清洗液1(1mL)42,5min,吸除孵育清洗液1,该过程重复2次 孵育清洗2(2次加人孵育清洗液2(I lml),37C,5min,吸除孵育清洗液2,该过程重复2次 显色 加人显色液1mL.37C,静止显色15nmin,吸除显色液 显色清洗(2次加人去离子水1mL,37,5min,吸除去离子水,该过程重复2次 结果判读 根据杂交点显色情况进行结果判读 9.4.4.3自动杂交仪测定过程 按芯片自动杂交仪操作说明书进行开机,预热,之后将包装有膜芯片的杂交盒放人自动杂交仪中开 始杂交过程,依次自动完成去活化、杂交、清洗、酶孵育、显色等步骤,自动完成杂交过程
具体过程如表11所示
表11自动杂交仪测定过程 程序名称 试剂名称 温度/ 时间/min 去活化 去活化液 37 去活化清洗 去活化清洗液 60 杂交 杂交液 42 52 杂交清洗 杂交清洗液 52 杂交清洗 杂交清洗液 酶孵育 孵育液 42 30 孵育清洗1 孵育清洗液1 42 孵育清洗1 孵育清洗液1 42 37 孵育清洗2 孵育清洗液2 孵育清洗2 孵育清洗液2 37 37 显色 显色液 15 31 显色清洗 去离子水 37 显色清洗 去离子水 结果判读 根据杂交点显色情况进行结果判读 9.5膜芯片结果判读 9.5.1目测判读 显色后的膜芯片可以用肉眼直接判读检测结果
阳性杂交信号为肉眼明显可见的蓝色斑点
如果 杂交点部位没有显色,和膜芯片背景相同,则判读为阴性杂交信号
10
GB/35535一2017 g.5.2膜芯片识读仪判读 膜芯片显色后,使用芯片识读仪进行扫描分析
如果杂交点部位显色,则判读为阳性杂交信号 如 果杂交点部位没有显色,和膜芯片背景相同,则判读为阴性杂交信号
10结果判断 0.1质量控制 10.1.1 质量控制原则 实验中设置10.1.210.1.4所述的质控对照,其膜芯片杂交检测结果应符合相应情况
如果出现 非10.1.2~10.1.4中所述的杂交结果,则应判断实验不成功,需重做实验
10.1.2核酸提取空白对照和多重CR扩增试剂空白对照 膜芯片上内源基因探针点杂交信号阴性,外源基因探针点杂交信号阴性,阳性对照探针点杂交信号 阳性,阴性对照探针点杂交信号阴性
0.1.3非转基因标准品对照 膜芯片上内源基因探针点杂交信号阳性,外源基因探针点杂交信号阴性,阳性对照探针点杂交信号 阳性阴性对照探针点杂交信号阴性
10.1.4转基因标准品对照 膜芯片上内源基因探针点杂交信号阳性,外源基因探针点杂交信号阳性,阳性对照探针点杂交信号 阳性,阴性对照探针点杂交信号阴性
10.2结果判断 10.2.1样本检测结果中阳性对照探针点杂交信号阴性,可初步判读膜芯片杂交过程不成功,应确认各 杂交试剂是否过期或保存条件不当,更换可疑试剂后重新实验
10.2.2样本检测结果中阴对照探针点杂交信号阳性,可初步判读膜芯片杂交过程不成功,应确认各杂 交试剂是否过期或保存条件不当,更换可疑试剂后重新实验
10.2.3样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阴性,表明未能从样本中提取出适宜多重PCR扩增 的核酸模板,需要重新进行样本核酸提取和多重PCR扩增
10.2.4样本检测结果中内 因探针点杂交信号阳性,外源基因探针点杂交信号阴性,表明样本核酸 源 ！ 基 提取、多重PCR扩增和膜芯片杂交过程正常,判断样本中未检出转基因成分
0.2.5样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阳性,各外源基因探针点杂交信号部分或全部阳性， 表明样本核酸提取、多重PCR扩增和膜芯片杂交过程正常,判读样本中存在阳性信号点对应的转基因 成分
确证实验 转基因成分膜芯片检测阳性样本可进一步进行确证实验,确证实验方法按照SN/T1204中规定的 方法执行
1
GB/T35535一2017 2结果表述 2.1未检出 在阴性质控探针杂交点阳性质控探针杂交点检测结果正常的情况下,未检出本标准所包含的外源 基因成分
2.2检出 检出××××基因,阴性质控探针杂交点、阳性质控探针杂交点的检测结果正常 12
GB/35535一2017 录 附 A 资料性附录 膜芯片法试剂组分和存放条件 膜芯片法试剂组分和存放条件参见表A.1
表A.1膜芯片法试剂组分和存放条件 序号 名称 存放条件 -20 多重PCR即用型预混液 多重PCR引物预混液 -20 无核酸酶灭菌水 -20 " 转基因标准品基因组DNA(50ng/gL 20 20 阳性寡核苷酸单链DNA(Positive-Oligo,10mol/1L 去活化液 室温 去活化清洗液 室温 杂交液 室温 杂交清洗液 室温 酶孵育液 室淋 10 碱性磷酸酶标记的链霉亲和素 12 室温 孵育清洗液" 13 孵育清洗液2 室温 14 心 BCIP/NBT显色底物 15 膜芯片 室温 13
GB/T35535一2017 附 录 B 资料性附录) 膜芯片法检测流程 膜芯片法检测按照图B.1流程进行
待测样品 核酸提取 多重CR扩增 膜芯片杂交 芯片结果判读 阴性 阳性 报告结果 图B.1膜芯片法检测流程 14
GB/35535一2017 录 附 C 资料性附录 膜芯片制作与质量控制 膜芯片制作 C.1 采用微定量喷点式膜芯片点样仪,将各个核苷酸探针(探针终浓度25mol/L)分布在带负电荷尼 龙膜芯片上的特定位置区域
芯片表面包被的探针布局如图C.1、图C.2
杂交阳性对照;PC,监测芯片杂交过程是否正常
大豆内对照;lL.eetin,膜芯片上用来质控PCR扩增过程是否正常的对照,使用大豆特异性内源基因 Lectin扩增片段互补的一段寡核苷酸作为探针 油菜内对照;PEP,膜芯片上用来质控PCR扩增过程是否正常的对照,使用油菜特异性内源基因 PEP扩增片段互补的一段寡核苷酸作为探针
阴性对照:NC,膜芯片上用来质控探针杂交特异性的对照
一般使用一段与粑标分子序列相近或 无关的寡核苷酸作为探针
Lcctin EPSPS GAT4601 Cy1Ae FMV35S" CaMV35SPcaMv35S-T PAT NOS-3 Blank PC NC 图c.1大豆芯片探针布局
GB/T35535一2017 PEP EPSPS GOX PAT BAR BARNASE NPT-l BARSTAR FMv35S-p CaMV35SPCaMV35S-T NOs-3'" Blank Blank PC 图c.2油菜芯片探针布局 膜芯片的质量控制 膜芯片点样后扫描无漏点,连点,位点规则,大小均匀一致,点与点的距离为3004m一5004m;杂 交后阳性质控实验杂交信号清晰可见
大豆、油菜中外源基因成分的测定膜芯片法GB/T35535-2017
随着生物技术的不断发展，转基因作物已经广泛应用于全球各地的农业生产中。然而，由于其潜在的食品安全问题，越来越多的国家都开始实施转基因食品的标识和监管制度。因此，开发高效、准确的检测方法成为了至关重要的任务。
在大豆和油菜等农作物中，存在外源基因成分的可能性。这些外源基因可能来自于转基因作物或者其他植物种类的杂交。为了快速、准确地检测这些外源基因成分，我们采用了膜芯片技术。
膜芯片技术是一种高通量的检测方法，可以在一张小小的膜芯片上同时检测多个样品。该技术基于DNA杂交原理，将目标序列探针固定在膜芯片表面上，与待检测样品中的DNA进行杂交反应。通过对反应结果的分析，可以快速准确地确定样品中是否存在目标序列。
我们开发的大豆、油菜外源基因成分测定膜芯片符合GB/T35535-2017标准，具有如下特点：
- 高通量：一张膜芯片可以同时检测多个样品，提高了检测效率；
- 高准确性：采用高度特异性探针，能够识别目标序列并避免误报；
- 高灵敏度：可检测到非常低浓度的外源基因成分，提高了检测的可靠性；
- 高重复性：反应条件一致，不同批次的检测结果具有较高的一致性。
总之，大豆、油菜外源基因成分测定膜芯片是一种高效、准确、可靠的检测方法，为转基因食品监管提供了有力支持。
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