Sanger法测序技术指南

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国家标准 GB/T34265一2017 Sanger法测序技术指南 GuideforthemethodofSangersequeneing 2017-09-07发布 2018-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/34265一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口 本标准起草单位:深圳华因康基因科技有限公司、深圳市华因康高通量生物技术研究院、广州康昕 瑞基因健康科技有限公司,武汉康听瑞基因健康科技有限公司、测试技术研究院、上海交通大学医 学院附属瑞金医院、国家人类基因组南方研究中心、计量科学研究院、中山大学肿瘤防治中心 本标准主要起草人:盛司潼、谭辉彪、李花、曾涛、杨杰斌、周李华、张俊、王升跃、全灿、陈功
GB/T34265一2017 引 言 基因测序方法是基因科技产业链的核心技术,其发展状况直接关系到生物产业的发展状况,对生物 学,癌症攻克、遗传学、医药研制、药效分析、农业、新能源、国家民族战略安全和人类生命健康安全具有 至关重要的支撑作用 基因测序技术在全球的发展非常迅速,目前实际应用最广泛的是Sanger测序方法,它是超高精度 测序的黄金标准,是迄今为止唯一既能用于人类基因组提供从头测序,又能用于从头组装的技术 将 San anger测序方法标准化并加以推广应用,生物企业乃至整个国内行业就会获得一个绝好的技术规范和 保护自我发展的壁垒,推动整个行业产业链的发展,提升整个行业的技术实力 早日实现Sanger测序 方法的标准化将对我国基因生物检测产业这一战略性新兴产业的发展起到至关重要的促进作用 为 了使Ssanger测序方法更加规范,有效发挥其重要的科技支撑作用,有必要对其制定标准 由于Sanger测序方法并非单一技术,涉及到不同技术领域的结合,包括生物、化学,机械、数据处理 等,因此本标准仅对Ssanger法基因测序的术语,技术指标,以及所涉及的仪器设备.试剂,方法进行说明 和规定
GB/34265一2017 Sanger法测序技术指南 范围 本标准规定了Sanger测序方法的术语和定义、缩略语,原理、主要仪器设备.Ssanger去基因测序 指标,Ssanger法基因测序方法,Sanger法基因测序的应用 本标准适用于对动物组织、植物组织、血液、口腔黏膜,毛发、粪便、土壤、微生物等生物样品中的 DNA通过Sanger测序方法进行测序 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 基因测序genesequeneing 对核酸分子的核苷酸排列顺序的测定,即测定组成核酸分子的腺瞟岭(A)、鸟喋岭(G),胞嗜(C) 和胸腺密(T)或者是尿嗜(U)的排列顺序 [GB/T309892014,定义3.18 3.2 ia咪fsnger Samger测序方法method seguencing 用于基因测序的双脱氧链末端终止法,在链延伸过程中利用荧光标记双脱氧碱基随机阻断,产生以 A、T,C,G结束的四组不同长度的核苷酸链,通过读取荧光信号实现对核酸碱基序列信息的读取 3.3 变性denaturation 蛋白质或核酸的二级或三级结构在物理或化学因素作用下被改变而导致其理化性质改变和生物活 性丧失的现象 3.4 引物 primer 在DNA复制过程中,结合于模板链上并作为复制延伸的起始位点和/或终止位点的,具有一定长 度和顺序的寡核昔酸链 [GB/T309892014,定义3.11] 3.5 测序读长readlengthofgenesequeneing 测序能测得的最长基因片段的长度 注通常以碱基数表示
GB/T34265一2017 [GB/T30989一2014,定义3.24] 3.6 QV值quality Value 用于表示测序结果准确质量的数值 注:QV10代表90%的准确度.Qv20代表99%的准确度.Qv30代表99.9%的准确度.QV40代表99.99%的准确 度,QV50代表99.999%的准确度 3.7 不可信区域 unreliablearea 测序结果序列两端QV值低而不作为结果分析的区域 缩略语 下列缩略语适用于本文件 DNA;脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) ddNTP;双脱氧核糖核苷三磷酸(doubledeoxy-ribonucleosidetriphosphate NTP;脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate) EDTA:;乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) NaAe;醋酸钠(odiwm" acetate PCR:聚合酶链式反应(polymeraseG chainreaction RNA;核糖核酸(ribonucleicacid) 5 原理 5.1碱基互补配对原理 在DNA分子结构中,碱基之间的氢键具有固定的数目，且DNA两条链之间的距离保持不变 DNA分子结构中的4种碱基之间的配对遵循一定的规律,即A仅与丁配对,G仅与C配对,反之亦然 腺瞟吟与胸腺嗜之间有两个氢键,鸟瞟吟与胞喀唁之间有三个氧键,即A=T,G;=c 根据碱基互补 配对的原则，一条链上的A的数量等于互补链上的T的数量;一条链上的G的数量等于互补链上的c 的数量,反之亦然 5.2Sanger法测序原理 每一轮序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种dNTP,并混人少量一种 ddNTP 由于ddNTP缺乏延伸所需要的3'-OH基团,在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键,用来 中断DNA合成反应,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止 在4个DNA合成反应体 系中分别加人一定比例的带有荧光同位素标记的某种ddNTP,通过凝胶电泳和放射自显影,就可以根 据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列 Sanger法测序原理示意图参见附录A 主要仪器设备 o 6.1电子天平,相关指标宜参照GB/T26497一2011 6.2电泳装置,相关指标宜参照YY/T0087一2004 6.3电泳凝胶成像系统 6.4离心机,相关指标宜参照YY/T0657一2008
GB/34265一2017 6.5用于溶解电泳胶时进行加热的加热装置,最高温度可达到60C 6.6用于测定核酸浓度的设备,如分光光度计、核酸定量分析仪 6.7PCR仪,相关指标宜参照YY/T1173一2010. 6.8基因测序仪 Samger法基因测序指标 7.1测序样品 7.1.1质粒样品 质粒浓度宜大于或等于50ng/L,体积宜大于或等于10ML,反应数增加时,所需的体积数宜相应 增加;质粒样品宜溶于一级水,一级水应符合GB/T6682的要求;质粒纯化后的OD260nm/OD280nm 值宜在1.6至2.0之间;推荐明确载体及预期插人目的片段的长度 7.1.2纯化PCR产物 纯化PCR产物在电泳检测中条带单一,并与目的片段大小一致;纯化PCR产物宜溶于一级水,纯 化PCR产物的OD260nm/OD280nm值宜在1.6至2.0之间;PCR产物片段小于150bp时,建议对其 进行克隆后再测序 7.1.3未纯化PCR产物 未纯化PCR产物在电泳检测中可分辨出目的条带;PCR产物片段宜大于或等于200bp,若产物片 段小于150bp时,建议对其进行克隆后再测序 7.2测序引物 测序引物宜在17bp至25bp之间,测序引物的T 值宜在55C至65之间;测序引物与待测样 品之间宜仅有一个结合位点;测序引物建议避免形成引物二聚体、发卡结构或复杂二级结构;随机引物、 兼并引物和混合引物不宜作为测序引物 7.3测序模板用量 纯化后PCR产物模板用量 产物片段长度为100bp200bp时,用量宜为1ng3ng; aa b 产物片段长度为200bp500bp时,用量宜为3ng~10ng; 产物片段长度为500bp1000bp时,用量宜为5ng20 c ng; d 产物片段长度为1000bp~2000bp时,用量宜为10ng一40ng; 产物片段长度大于2000bp时,用量宜为20ng~50 e ng 其他模板用量,质粒用量宜为100ng300 ng;大分子量模板如Cosmid,BAC)宜大于或等于 0.5 54g;细菌基因组DNA宜大于或等于2g 7.4反应体系 按基因测序仪厂家说明书要求的配比配制反应体系 相关试剂及溶液的配制参见附录B. 7.5标记物 标记物宜采用HEX、JOE,ROX、TET、TAMRA、FAM、LIZ、VIC、NED或PET,标记物激发波长
GB/T34265一2017 520nm、588 52lnm,56o 、494 .638 ,538mm.546mm.58mm. 宜为535 nm、 nm、 nm、" nm、 nm、 7.6测序结果 7.6.1测序读长 当待测核酸片段长度超过所使用仪器有效读长时,测序读长宜达到所使用仪器的有效读长;当待测 核酸片段序列长度小于所使用仪器的有效读长时,测序读长宜包括待测核酸片段序列全长 7.6.2QV值 可信区域的QV值建议达到QV20,QV=-10×lgPe,Pe代表碱基读取的错误率,QV20表示99% 准确率 8 Samger法基因测序方法 8.1总则 首先利用测序样品通过测序PCR反应获得待测序产物,然后对待测序产物进行纯化与变性后,将 变性产物上样至基因测序仪中电泳,获得电泳图谱,经基因测序仪配套的数据分析系统对图谱进行分析 后,获得所测序列信息,并形成碱基序列输出 8.2测序PCR反应 8.2.1配制反应体系 按拟采用的Sanger基因测序仪的配套试剂要求的配比配制 测序反应体系的配制可参照附录C 进行 8.2.2PCR扩增程序 根据待测样品的大小及测序引物T值,调整扩增程序,扩增程序中的退火温度宜在50C~ 55C,扩增程序参见附录D. 8.3待测序产物纯化 宜采用乙醇/EDTA/NaAc法对待测序产物进行纯化,让残余乙醇挥发干,每个样品加人10L 甲 酰胺 乙醇/EDTA/NaAc法参见附录E 8.4待测序产物上样电泳 8.4.1毛细管灌胶 安装毛细管并对其位置进行校正,然后通过人工手动或者由仪器自动对毛细管进行灌胶 8.4.2电进样及电泳 毛细管和电极伸人样品溶液中,加上电压使得待测序产物中带负电的DNA分子进人毛细管,并在 电场的作用下向阳极泳动 8.4.3荧光激发及检测 待测序产物中带有荧光标记的DNA片段按大小依次通过激光检测区,受激发出荧光,产生荧光信
GB/34265一2017 号并被荧光信号收集器收集,收集到的荧光信号将通过配套处理软件转换成电泳图谱 8.5数据分析,序列输出 通过配套的数据分析系统对图谱数据进行序列分析,得出所测基因序列信息,形成碱基序列输出 samger法基因测序的应用 Sat anger法测序技术可以应用在多个方面;DNA测序中的再测序,种属鉴定,基因型分析和基因突 变检测,农牧业育种,遗传病诊断,药物疗效和个体化差异的筛查,产前诊断,亲子鉴定
GB/T34265一2017 附 录 A 资料性附录) Sanger法测序原理示意图 Sanger法测序原理如图A.1所示 退火 廷伸 产物 变性 Degencration (Extcnsion (Prodcts) mneaing G 图A.1Sanger法测序原理示意图
GB/34265一2017 录 附 B 资料性附录 试剂及溶液配制 B.1乙醇醋酸钠混合物的配制 将50mL无水乙醇与2mL的Na.Ac(3nmol/LpH5.2)、10ml一级水混匀即可 B.275%乙醇 将75m的无水乙醇加25ml.的一级水混匀,存于一20C B.3引物配制 根据所需引物量,按下述配比进行稀释 0AL 10mol/AL的引物加21.25L的一级水,混匀即得3.24mol/L的引物
GB/T34265一2017 附 录 资料性附录) 测序反应体系的配制 C.1相关试剂配制 2.5×BigDyeV3.1Mix的配制将BigDyeV3.1Mix原管(10×)解冻低速短暂离心,原液分装 25L到1.5mL的Ep管中备用;然后在需使用的Ep管中,加人75L的一级水,震荡混匀即可得到 2.5×的BigDyeV3.1Mix C.2测序反应体系配制 测序反应体系配制参照表C.1进行 表c.1测序反应体系配制表 试剂名称 浓度 体积/pL BigDyeV3.1Mix 2.5× BigDyeSequeneingBaufer 5.0X 模板 根据7.3的用量配制相应浓度 引物 3.24mol/L -级水 加至总体积为20L 注:根据所需的反应体系大小,可在保证BigDye的终浓度为1×的情况下,按上述配比进行相应调整
GB/34265一2017 附 录 D 资料性附录 扩增程序 根据待测样品的大小,以所选用基因测序仪的有效读长为分界点,分别选择相应的扩增程序进行扩 增,程序如下 -般测序 a 961min 96C10s,50C5s,60C4nmin;重复25个循环 4C保温 大分子测序 b 95C5min 9630s，50C一55C10s,60C4min;重复50个循环; 4保温 注:根据待测样品的实际大小、,测序引物的T 值,上述扩增程序中的延伸时间,退火温度可进行相应的调整
GB/T34265一2017 附 录 资料性附录) 待测序产物纯化 待测序产物的纯化一般采用乙醇/EDTA/NaAc法纯化,步骤如下 将测序PCR产物短时离心,从而将待测序产物转移至96孔板底部 a b) 加乙醇醋酸钠混合物31AL/反应,涡旋混匀4次以上,避光静置15nmin 4C、4000r/min离心30min,马上倒置96孔板,短时离心至转速达900r/min(约140g)时 c 终止离心; 每反应加100AL75%乙醇,4C、4000r/min离心5min;然后马上倒置96孔板,短时离心至 d 转速达900r/min(约140g)终止离心 室温放置15min,每反应加10Al甲酰胺,盖好,涡旋4次以上混匀,短暂离心,室温5min 溶解 如果不是用测序96孔板纯化,则需将样本转移至测序96孔板，盖好 并对测序96孔板孔中 对应的样本进行记录 注:可采用等效试剂盒进行纯化 0
GB/34265一2017 参 考文献 GB/T6379.1一2004测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第1部分;总则与定义 [2]GB/T26497一201m 电子天平 [3 GB/T30989一2014高通量基因测序技术规程 [门 YY/T0087一2004电泳装置 [5幻 YY/T0657一2008医用离心机 [们 YY/T1173一2010聚合酶链反应分析仪 [刀 ISO5725-l:1994 Accuracy(truenessandprecision)ofmeasurementmethodsandresults Part1:Greneral anddefinitions lprineiplee [[8]AppliedBiosystems3500Dx/3500xLDx基因分析仪用户指南 [[9]AppliedBiosy 3500/3500XL遗传分析仪建议操作指南 ystemS 10]F.Sanger，S.NicklemandA.R.Coulson.DNAsegu puencingwithchain-termnatmg" inhibitors [] PNAS，1977,74,12:5463-5467.

Sanger法测序技术指南GB/T34265-2017

在基因组学领域，Sanger法测序是一种常用的测序技术。它是由 Frederick Sanger 在1977年发明的，也被称为“链终止法”或“二代测序技术”。相较于其他测序技术，Sanger法测序具有以下优点：

• 能够测序长达1000个核苷酸的DNA序列；
• 高精度：错误率低于0.1%；
• 可靠性强：已经广泛应用于人类基因组计划等大型研究项目中。

下面我们将介绍如何使用 GB/T34265-2017 标准，来对样品进行 Sanger法测序。

实验步骤：

1. 制备DNA样品：从样品中提取DNA（例如血液、组织、唾液等），并使用PCR扩增所需的片段。
2. 准备反应体系：将扩增产物与引物、Taq酶、dNTPs等混合，制成反应体系。
3. Sanger测序反应：在反应体系中加入一定量的不同荧光标记的二代碱基链终止剂（ddNTPs），并进行PCR扩增。该过程会生成一系列长度不同的碎片，每个碎片以一种不同的颜色标记。
4. 读取数据：使用自动DNA测序仪读取所有碎片的荧光信号，并由计算机将它们转换成原始DNA序列。
5. 测序结果分析：通过对序列的比对和组装，可以得到完整的DNA序列。

在使用 Sanger法测序 技术时，需要注意以下几点：

• 样品质量对结果影响很大，因此必须保证样品纯度和完整性。
• 在选择荧光标记的二代碱基链终止剂时，要根据需要测序的片段长度进行选择。
• 在读取数据时，需要对荧光信号进行峰检测和峰拟合，以获得最准确的数据。

总之，Sanger法测序技术是一种非常有效的测序方法，它可以在基因组学、疾病诊断等领域中得到广泛应用。GB/T34265-2017 标准规范了 Sanger法测序 技术的操作流程和实验室质量控制要求，为相关科研人员提供了更加标准化和规范化的指导。

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2022/9/10 8:26:45 现行

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