国家标准 GB/T39303一2020 废水处理系统微生物样品前处理通用技术规范 Generalteechniealspeeifieationforpre-treatmentofmieroorganism samplesinwastewatertreatmentsystem 2020-11-19发布 2021-10-01实施国家市场监督管理总局发布国家标涯花管理委员会国家标准

GB/39303一2020 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由石油和化学工业联合会提出本标准由全国化学标准化技术委员会(SAC/Tc63)归口本标准起草单位:南京大学、南京大学宜兴环保研究院、南京江岛环境科技研究院有限公司、中海油天津化工研究设计院有限公司蓝保厦门)水处理科技有限公司,东莞理工学院、国网天津市电力公司电力科学研究院、石家庄给源环保科技有限公司、珠海京工检测技术有限公司本标准主要起草人:任洪强、何席伟、张徐祥、白莹、吕奋勇、牛军峰、苏展、耿金菊、李永广、王庆、王磊、吴兵

GB/39303一2020 废水处理系统微生物样品前处理通用技术规范范围本标准规定了废水处理系统中微生物样品的现场处理、微生物菌种分离与保藏、微生物样品宏基因组DNA提取以及微生物样品的保存本标准适用于采用生物处理工艺(活性污泥法工艺和生物膜法工艺)的废水处理系统中微生物样品的现场处理,提取与保存规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 HJ91.1污水监测技术规范 SN/T2632微生物菌种常规保藏技术规程术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3.1 微生物样品micrworganismsaples 已培养或已提取纯化的,可直接应用于分析研究的各种菌株(包括细菌,真菌、放线菌等)、,DNA等遗传物质;以及包含上述菌株和遗传物质的废水处理系统中的进出水样品、活性污泥样品、生物膜样品等 3.2 前处理pre-treatment 在开展废水处理系统微生物研究工作之前对采集的各种微生物样品所进行的各种处理 3.3 宏基因组metagenome 不经菌株分离筛选步骤,直接从环境样品中提取的遗传物质(DNA或RNA),包含了样品中所有微生物的遗传信息 [[GB/T307442014,定义3.l.6] 缩略语下列缩略语适用于本文件 CTAB;十六婉基三甲基澳化铵(Cetyltrimethylammoniumbromide' DNA;脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleiecacid EDTA;乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetieacid
GB/T39303一2020 LB;肉汤培养基(Luria-bertani) OD;光密度(Optiealdensity RNaseA:核糖核酸A SDS;十二婉基硫酸钠(Sodiumdodeeylsulfate) TE;Tris-HCl和EDTA-2Na配成的缓冲液 Trs.三系甲基氨基甲烧(2-Amino2-hydroxymethyll.3propanedioD 16SrRNA基因:细菌染色体上编码核糖体RNA16S亚基的基因 18SrRNA基因:真核生物染色体上编码核糖体RNA18S亚基的基因 5 试剂或材料 5.1本标准所用试剂和水,除非另有规定,应使用分析纯试剂和电阻率大于18Mnem的超纯水 5.2无水乙醇 5.3异丙醇 5.4盐酸溶液:1mol/儿L 量取83mL盐酸,缓慢加人917mL水中,混匀 5.5氢氧化钠溶液;40g/L 5.6重铬酸钾溶液;5g/I 5.7SDS溶液;100g/L 5.8生理盐水;称取9gNaCI,溶于1L.水中混匀后在高压灭菌锅中121C灭菌20min(简称灭菌处理). 5.9乙醉溶液;50% 5.10乙醇溶液;75% 5.111/3000孟加拉红溶液(玫瑰红水溶液);称取1只孟加拉红溶解于3L.水中 5.12链霉素溶液:0.3g/T .w" 5.13Tris-HCl贮液;lmol/儿L 称取121.14gTris,溶解于800ml.水中,用盐酸溶液调节pH值至 8.0,加水稀释至1L 5.14Tris-Hcl溶液;移取10.00mlTris-Hcl贮液置于1L容量瓶中,用水稀释至刻度 5.15DNA抽提缓冲液;称取37.3gEDTA-2Na、17.8只磷酸氢二钠(Na.HPO2H.O)、15.6g磷酸二氢钠(NaH,PO2H,O),87.8只氯化钠和10gcTAB,溶解于700ml.水中,加人100mLTris-HCl 贮液,用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节pH值至8.0,加水稀释至1L后灭菌处理 5.16TE游液;称取0.373区EDTA2Na,游解于800ml水中,加人10ml.TrisHcI贮液,用氢氧化钠溶液调节pH值为8.0,加水稀释至1L后灭菌处理 5.17酚-氯仿-异戊醉溶液:将500mlTris饱和酚、480mmL氯仿和20mL异戊醉溶液混合均匀,贮存于棕色玻璃瓶中,4C可保存两周 5.18LB培养基;称取10只蛋白陈,5只酵母膏,10只氯化钠,18只琼脂粉溶解于11水中,混匀后灭菌处理 5.19高氏一号培养基:称取20g可溶性淀粉,1g硝酸钾,0.5g磷酸氢二钾,1g硫酸镁(MgSO 7H.O),0.01g硫酸亚铁,溶解于1L水中,用氢氧化钠溶液调节pH值至7.27.4 加人10ml 重铬酸钾溶液,再加人18g琼脂粉,混匀后灭菌处理马丁民培养基,称取10【葡萄糖.5蛋白陈,区精股二氢娜,0s【硫酸镇(Mgso. 7H.O),溶 5.20 解于800mL水中,加人100mL1/3000孟加拉红溶液,再加人18g琼脂粉,混匀后灭菌处理冷却至 0仑一0C时,加人100ml链霉素游液,混匀 5.21溶菌酶贮液:10g/L 称取1g溶菌酶,溶解于100mLTris-HCI溶液于一20C保存 5.22RNaseA贮液:10g/L 称取1gRNaseA,0.09gNaCI,溶解于100mL预先用盐酸溶液调节
GB/39303一2020 pH值至7.5的Tris-HCI溶液,于100C加热15min,按每管1mL分装,于-20C保存 5.23无菌滤膜;直径47mm,孔径为0.22m或0.45m的混合纤维素酯滤膜 5.24离心管;材质为聚丙烯仪器设备 6.1真空泵;真空度大于或等于-80kPa,空载流量大于或等于20L/min. 6.2砂芯过滤器;滤头直径为50mm,接收瓶体积为500ml1000ml的砂芯过滤器 6.3超低温冰箱;最低保存温度为-80C 6.4高速冷冻离心机;配有50mL离心管温度调节范围4C一20C,转速0r/min18000r/min. /min300r/min 6.5振荡培养箱:温度调节范围0C一60C,转速0r 6.6生化培养箱;温度调节范围0C一60 6.7高压灭菌锅温度可升至121C,压力可维持0.1MPa一0.15MPa 6.8超净工作台;洁净度级别100级 6.9恒温水浴锅;温度调节范围室温99 6.10光学显微镜;放大倍数40X一2000X 6.11微量移液枪:100L1000L 6.12涡旋仪;转速0r/min3000r/min. nmm850nm 6.13超微量紫外分光光度计:波长范围200 样品的现场处理 7.1 一般规定 7.1.1样品的现场处理包括样品的分装、固定与现场保存,样品包括水样、活性污泥样品以及生物膜样品采样前应了解废水处理系统的处理工艺,废水类型和废水排放规律等情况,并拨H9l.l的规定 7.1.2 进行采样 7.1.3用于分样和装样的器具均应灭菌处理,如现场条件无法实现,应用75%乙醉溶液擦拭后使用 7.2水样的现场处理 7.2.1用于菌种分离的水样处理将无菌滤膜置于砂芯过滤器内,使用真空泵对水样进行抽滤滤膜的过水量视水样的浑浊程度而定，通常进水水样每张滤膜的过水量为50ml200mL,出水水样每张滤膜过水量为500mL 1000mL;水样过滤应于2h内完成过滤后,将滤膜放人50ml离心管中,于1C5C保存 7.2.2用于宏基因组DNA提取的水样处理 7.2.2.1按7.2.1操作将水样进行过滤处理,过滤后,将滤膜放人50mL离心管中,于一20C保存 7.2.2.2若水样不能进行现场过滤,应将水样置于1C5C保存,并于24h内带回实验室进行过滤处理 7.3活性污泥样品的现场处理 7.3.1用于镜检或菌种分离的活性污泥样品处理将采集的泥水混合物静置5min~ 15min至泥水产生明显分层,弃去上层清液,将下层活性污泥装
GB/T39303一2020 人50mL离心管中,于1C5C保存 7.3.2用于宏基因组DNA提取的活性污泥样品处理将采集的泥水混合物静置5min一15min至泥水产生明显分层,弃去上层清液,将下层活性污 7.3.2.1 泥装人50mL离心管中,于一20C保存 7.3.2.2若现场无法进行一20C保存,可在装有活性污泥的离心管中加人等体积的无水乙醇进行固定后于1C一5C保存 7.4生物膜样品的现场处理 7.4.1用于镜检或菌种分离的生物膜样品处理 7.4.1.1用铲子或刀片等工具将生物膜从反应器内的填料(主要见于移动床生物膜反应器工艺、生物接触氧化工艺、生物滤池工艺等,生物转盘(主要见于生物转盘工艺)或滤膜(主要见于膜生物反应器工艺)表面刮下,装人50mL离心管中,于1C5C保存 7.4.1.2对于难以刮取的填料附着型生物膜样品,直接采集其附着的部分填料装人聚丙烯采样瓶中(采样瓶规格可视填料尺寸而定),于15C保存 7.4.2用于宏基因组DNA提取的生物膜样品处理用铲子或刀片等工具将生物膜从反应器内的填料、生物转盘或滤膜表面刮下,装人50mL离 7.4.2.1 心管中,于一20C保存 7.4.2.2对于难以刮取的填料附着型生物膜样品,直接采集其附着的部分填料装人聚丙烯采样瓶中(采样瓶规格可视填料尺寸而定),于一20C保存 7.4.2.3若现场无法进行一20保存,可在装有生物膜的离心管或装有填料的采样瓶中加人50%乙醇溶液,将生物膜或填料浸没、固定,于1一5C保存 7.5数据记录将采样时间,地点、样品类型、工艺类型,采样方式、处理方式、样品体积、保存方式等参数记录于废水处理系统微生物样品现场处理记录表(参见附录A中表A.1) 8 菌种分离与保藏 8.1 -般规定 8.1.1菌种分离是指从所采集的水样、活性污泥以及生物膜样品中分离微生物菌株包括细菌、放线菌、真菌 B.1.2进行微生物菌种分离应选用1C一5C保存的未经固定的样品 8.1.3菌种分离与保藏工作应在无菌条件下进行,所用的离心管、枪头、配制的溶液均应灭菌处理,冷却后使用 8.1.4细菌的分离筛选采用LB培养基;放线菌的分离筛选采用高氏一号培养基;真菌的分离筛选采用马丁氏培养基 8.2微生物的分离培养 8.2.1分离培养样品前处理 8.2.1.1含菌滤膜的前处理:取经7.2.1处理而得的含菌滤膜一张,在超净工作台中剪碎装人50mL离
GB/39303一2020 心管中,加人20mL生理盐水使其浸没,在涡旋仪上振荡1min制成菌悬液,除去滤膜,取10mL菌悬液待用 8.2.1.2活性污泥的前处理:取1mL经7.3.1处理而得的活性污泥,用生理盐水稀释到10mL,在涡旋仪上振荡30s使其混匀后待用 8.2.1.3生物膜的前处理;对于从填料或生物转盘上刮下的生物膜,取1mL经7.4.1.1处理而得的生物膜,用生理盐水稀释到10mL,在涡旋仪上振荡30、使其混匀后待用对于附着于填料上的生物膜,取 0只经7.4.1.2处理而得的填料放人三角瓶中(三角瓶体积视填料尺寸而定),加人生理盐水使其浸没在250r/min的振荡培养箱振荡2min制成菌悬液,取10mL菌悬液待用菌种的分离 8.2.2 8.2.2.1取1mL.8.2.1制得的菌悬液,用生理盐水稀释到10mL,制成10-'样品稀释液,振荡均匀 8.2.2.2取1ml8.2.2.1制得的菌悬液,用生理盐水稀释到10ml,制成10-"样品稀释液,振荡均匀 8.2.2.3按上述步骤依次稀释成10-了10-'的样品稀释液,振荡均匀 8.2.2.4取各梯度样品稀释液100L分别涂布于培养基平板上,LB培养基37C倒置培养2d3d. 高氏一号培养基28倒置培养3d一5d,马丁氏培养基28C倒置培养5d7d,观察菌落生长情况 8.2.2.5将长出的单菌落分别转接到新的相同培养基平板上,并做好相应的记号,于相同温度下继续培养 8.2.2.6将平板上长出的单菌落多次划线分离培养,根据平板上的菌落形态和颜色,辅以镜检检测,直至获得纯的单菌落 8.2.2.7对获得的单菌落,通过比较细菌和放线菌的16SrRNA基因序列,或真菌的18srRNA基因序列,进行菌种鉴定,排除重复的菌株 8.3菌种保藏按照SN/T2632操作 8.4数据记录将所分离的菌株来源、种属、培养条件、保存方式等相关参数记录于废水处理系统微生物分离鉴定记录表(参见表A.2) 微生物样品宏基因组DNA提取与保存 g.1一般规定 g.1.1进行宏基因组DNA提取应选用-20C保存的样品,或经乙醉固定的样品 9.1.2宏基因组DNA提取过程中,所用的离心管、枪头、配制的溶液均应灭菌处理,冷却后使用 9.1.3用超微量分光光度计测定DNA溶液的浓度和纯度,宏基因组DNA应达到的质量标准为: OD,/oD.的比值在1.82.0之间,且oD/OD.的比值大于2.0 9.2宏基因组DNA提取样品前处理含菌滤膜前处理.取经7.2.2处理而得的含菌滤膜二至四张,在超净工作台用灭菌剪刀将含菌滤 9.2.1 膜剪成碎片,浸泡于装有生理盐水的50ml离心管中,充分振荡制成菌悬液,除去滤膜,菌悬液经 8000r/min离心分离10min后弃去上层清液,沉淀用于宏基因组DNNA提取 9.22活性污泥前处理.将经7.3.2处理的活性污泥于8000r/min下离心分离2mn,弃去上层清液
GB/T39303一2020 沉淀用于宏基因组DNA提取 9.2.3生物膜前处理:对于从填料或生物转盘上刮下的生物膜,若经过固定,则将混合物于8000r/minm 下离心分离10min,弃去上层清液,沉淀用于宏基因组DNA提取,未经固定的生物膜可直接用于宏基因组DNA提取;对于填料附着型生物膜,将填料浸泡于装有生理盐水的三角瓶中,振荡制成菌悬液,于 8000r/min 下离心分离10min后弃去上层清液,沉淀用于宏基因组DNA提取 g.3宏基因组DNA提取 9.3.1向经9.2处理的样品中加人5mLDNA抽提缓冲液,混匀,在振荡培养箱中于37,200 r/min 条件下振荡30min 9.3.2加人1mlTE溶液和0.5ml溶菌酶贮液,继续振荡30min,加人0.5mlSDS溶液,于65C水浴30min后,6000r 离心分离10min,将上层清液转移至新的离心管中 /mln 9.3.3向沉淀中加人5mlDNA抽提缓冲液和0.5mlSDS溶液,于65C水浴10min,6000r/min下 n.将上层清液与9.a.2中的上清液合并于同一离心管中离心分离10 mln g.3.4重复9.,3.3步骤,将上层清液与9.3.2中的上清液合并于同一离心管中 9.3.5测量合并后的上层清液体积,加人RNaseA贮液至其终浓度为200/mL，于37C水浴 15min 下离心分离15min,将上层水相移加人等体积的盼叙仿异戊醇醉祥液,轻轻摇匀,13000r/minm 9.3.6 人新的离心管中,加人等体积的异丙醇,于一20C中沉淀1h后,于4C下13000r/min离心分离 10min,弃去上层清液 9.3.7向沉淀中加人200L无水乙醇,放置3s一5、后弃去无水乙醇,再重复一次,然后将沉淀物放置于超净工作台中吹干,加人50aLTE溶液溶解沉淀物,即为DNA溶液注1;宏基因组DNA也可采用商用试剂盒进行提取注2:若提取的DNA质量达不到9.1.3中的要求,可采用商用试剂盒进行纯化,或重新提取 g.4微生物样品保存 9.4.1水样按7.2.2或9.2.1处理后,将含菌滤膜或沉淀于一20C或一80C保存 9.4.2活性污泥和生物膜样品分别按9.2.2和9.2.3处理后,于一20C或一80C保存 9.4.3DNA样品保存前应分装多份,于一20C或一80C保存,避免反复冻融 9.5数据记录将所提取的微生物样品种类,DNA浓度、纯度、保存方式等相关参数记录于废水处理系统微生物样品宏基因组DNA记录表(参见表A.3)
GB/39303一2020 附录 A 资料性附录) 废水处理系统微生物样品前处理记录表表A.1一表A.3给出了废水处理系统微生物样品现场处理、菌种分离、宏基因组DNA提取记录表格式，表A.1废水处理系统微生物样品现场处理记录表第页共页时间: 地点:; 废水处理厂名称工艺类型样品编号采样位点样品类型采样方式样品体积处理方式保存方式备注采样人记录人校对人表A.2废水处理系统微生物分离鉴定记录表第共页页样品编号菌株编号菌株种属菌株来源培养基培养温度分离日期保存方式备注操作人校对人
GB/T39303一2020 表A.3废水处理系统微生物样品宏基因组DNA提取记录表第页共页样品编号 NA编号样品类型 DNA浓度 OD/ODm ODn/OD0 提取日期保存方式备注操作人校对人
GB/39303一2020 参考文献 [1]GB/T30744一2014深海微生物样品前处理技术规范

废水处理系统微生物样品前处理通用技术规范GB/T39303-2020解读

废水处理系统是现代工业化生产中必不可少的环保设施之一。随着环保意识的增强和环保法律法规的不断完善，对废水处理系统的要求也越来越高。为确保废水处理系统的运行效果和数据准确性，在取得废水处理系统微生物样品后，需要对样品进行前处理。

GB/T39303-2020技术规范是我国针对废水处理系统微生物样品前处理制定的专门标准。该技术规范中包含了样品采集、保存、转运、处理等多个方面的要求和规范。

样品采集

样品采集是废水处理系统微生物样品前处理的第一步。根据GB/T39303-2020的规定，应从废水处理系统的代表性污染物源、各种反应器和沉淀池等多个处所选择采样点位。

样品保存

样品保存是废水处理系统微生物样品前处理的重要环节之一。GB/T39303-2020规定，采集后的样品应立即进行冷藏，避免暴露在阳光下或高温环境中。同时，在转运过程中也需要注意避免样品受到振动和剧烈颠簸，以保证样品的完整性和准确性。

样品处理

样品处理是废水处理系统微生物样品前处理的核心环节。根据GB/T39303-2020的规定，样品处理主要包括预处理、分离、提取等多个步骤，用于去除样品中的杂质和干扰物，提高样品的纯度和测量灵敏度。

总的来说，废水处理系统微生物样品前处理通用技术规范GB/T39303-2020的发布，标志着我国在废水处理领域的技术水平达到国际先进水平。对于专业人士而言，了解并严格遵守该技术规范的要求，将有助于提高废水处理系统的运行效果和数据准确性。